西达本胺靶向P21调控DHFR表达逆转T淋巴细胞白血病甲氨蝶呤耐药的初步探究
The reversal of methotrexate resistance in T-lymphocyte leukemia by targeting P21 with chidamide to regulate DHFR expression
目的 探究西达本胺(CDM)靶向P21调控二氢叶酸还原酶(DHFR)表达逆转T淋巴细胞白血病(T-ALL)甲氨蝶呤(MTX)的耐药机制,为T-ALL靶向治疗提供参考依据.方法 将过表达载体(ov-DHFR)转染T-ALL细胞系Jurkat细胞,Western blot检测细胞中DHFR蛋白表达水平.将转染ov-DHFR载体的Jurkat细胞采用不同浓度(5、25和 40 μmol/L)的 MTX 处理、0.5 μ mol/L CDM 处理以及不同浓度(5、25 和 40 μmol/L)的 MTX 联合 0.5 μmol/L CDM 进行处理.采用25 μmol/L MTX、0.5 μmol/L CDM和25 μmol/L MTX+0.5 μmol/L CDM联合处理进行增殖、周期和蛋白检测.MTS实验检测转染ov-DHFR载体的Jurkat细胞对MTX耐药增殖,并计算相应的半抑制浓度(IC50)值.MTS、流式细胞和Western blot实验分别检测CDM+MTX处理对过表达DHFR的Jurkat细胞的增殖、周期及细胞中耐药蛋白和周期蛋白表达的影响.在MTX+CDM处理的过表达DHFR的Jurkat细胞增加P21抑制剂处理,MTS、流式细胞和Western blot实验分别检测CDM+MTX+P21抑制剂处理对过表达DHFR的Jurkat细胞的增殖、周期及细胞中耐药蛋白和周期蛋白表达的影响.结果 与转染阴性对照载体(ov-NC)组细胞MTX IC50值相比,转染ov-DHFR组Jurkat细胞的MTX IC50值变大.不同浓度的MTX和CDM处理发现25和40 μmol/L MTX+CDM组的治疗能够最显著地抑制过表达DHFR的Jurkat细胞的增殖,而且这两组治疗效果相似,因此后续采用25 μmol/L MTX+CDM组进行分析.与cell组相比,MTX组、CDM组和MTX+CDM组的过表达DHFR的Jurkat细胞在24、48、72 h这3个时间点,细胞的吸光度值均显著下降,差异均有统计学意义(F=40.180、378.900、510.700,P均<0.001).G1期的细胞比例均显著上升,而MTX+CDM组中表现最显著(F=7.419,P<0.001).Cyclin D、p-GP、BCRP蛋白表达水平均显著下调,且在MTX+CDM组细胞中表现最显著;此外,P21蛋白表达水平均显著增加,且在MTX+CDM组细胞中表现最显著.与MTX+CDM+PBS组相比,MTX+CDM+P21抑制剂组ov-DHFR-Jurkat细胞在48、72 h这2个时间点,细胞的吸光度值均显著上升,差异均有统计学意义(F=66.690、68.400,P均<0.001).与MTX+CDM+PBS组相比,MTX+CDM+P21抑制剂组ov-DHFR-Jurkat细胞中Gl期的细胞比例显著降低,差异有统计学意义(P<0.019);细胞中cyclin D、p-GP、BCRP蛋白表达水平均显著上调.结论 CDM靶向P21调控DHFR表达逆转T-ALL的MTX耐药.
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