目的:探究与自身抗体抗线粒体抗体Ⅱ型（AMA-M2）发生反应的侧链二氧酸脱氢酶复合体E2蛋白（BCOADC-E2）关键性氨基酸在原发性胆汁性胆管炎（PBC）诊断中的价值。方法:克隆能够表达BCOADC-E2蛋白抗原表位同源目的基因序列BCKD，与工程质粒pGEX-4T1进行DNA重组，通过PCR获得15个点突变质粒，转入原核表达菌株中进行蛋白表达与纯化；ELISA法、蛋白质印迹法鉴定其与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度并进行分析比较，定位出对BCOADC-E2蛋白和AMA-M2特异性反应有关键影响的氨基酸，探讨其在PBC诊断中的价值。统计学处理采用单因素方差分析、两两比较采用LSD- t检验。 结果:共获得14个突变型蛋白、1个野生型蛋白。突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A和pGEX-BCKD-C3A与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD与AMA-M2特异性反应程度；突变型蛋白pGEX-BCKD-S1A（1.634±0.328）和pGEX-BCKD-C3A（1.744±0.345）与PBC患者血清AMA-M2特异性反应程度均高于野生型蛋白pGEX-BCKD（1.000±0.000）与AMA-M2特异性反应程度；突变型蛋白pGEX-BCKD-E4A（0.157±0.067）、pGEX-BCKD-V5A（0.057±0.029）、pGEX-BCKD-Q6A（0.580±0.166）、pGEX-BCKD-S7A（0.744±0.125）、pGEX-BCKD-D8A（0.351±0.135）、pGEX-BCKD-S10A（0.496±0.158）、pGEX-BCKD-V11A（0.149±0.089）、pGEX-BCKD-T12A（0.061±0.043）、pGEX-BCKD-I13A（0.007±0.017）、pGEX-BCKD-T14A（0.198±0.101）、pGEX-BCKD-S15A（0.156±0.087）、pGEX-BCKD-R16A（0.884±0.099）与AMA-M2特异性反应程度均低于野生型蛋白pGEX-BCKD（1.000±0.000）与AMA-M2特异性反应蛋白。结论:BCOADC-E2蛋白的1号和3号位半胱氨酸是提高蛋白BCOADC-E2与PBC患者血清AMA-M2特异性反应关键性氨基酸；4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16号位氨基酸被丙氨酸代替后形成突变型蛋白会降低其与AMA-M2特异性反应程度；5号位和13号位氨基酸是影响蛋白BCOADC-E2与AMA-M2特异性反应关键性氨基酸，对BCOADC-E2蛋白功能有着重要影响，对BCOADC-E2关键性氨基酸进行深入研究对PBC诊治有重要意义。

目的:为探究发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)中Gc及其N-糖基化位点与病毒感染性的关系，构建了含有SFTSV Gc糖基化位点突变体的重组假病毒。方法:利用定点突变和同源重组技术构建了SFTSV Gc及3个N-糖基化位点突变的真核表达载体pcDNA3.1(＋)-Gc、pcDNA3.1(＋)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(＋)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(＋)-Gc(N374Q)。验证其在293T细胞中成功表达后，感染VSVΔG-Fluc*G假病毒，构建4株重组假病毒并检测其对细胞感染力的影响。结果:双酶切鉴定和序列测定证实成功构建真核表达载体pcDNA3.1(＋)-Gc、pcDNA3.1(＋)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(＋)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(＋)-Gc(N374Q)。间接免疫荧光和Western blot结果表明4个重组质粒均成功表达。SFTSV Gc重组假病毒对Vero细胞有感染特异性。糖基化位点突变后假病毒感染能力明显降低，且352位糖基化位点突变株感染水平最低( P<0.001、 P＝0.001)。 结论:SFTSV Gc的糖基化位点可能与病毒的感染力相关，且第352位氨基酸突变后，对病毒感染力影响最大。

目的 克隆并表达分离于我国3种类型的利什曼原虫K26基因,并用其检测我国内脏利什曼病特异性抗体,同时进行效果评价.方法 分别将我国新疆喀什(KS-6株)、四川九寨沟县(SC6株)和新疆伽师县(JIASHI-1株)K26基因进行全基因合成并加入BamH I与Xho I酶切位点,分别将K26基因连接至双酶切的pET32a表达载体,转入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中经1 mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化重组蛋白.用制备的3种抗原分别作为包被抗原,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病原学确诊的内脏利什曼病患者及其它寄生虫病患者和健康者的血清中和抗体,以评价其检测的敏感性和特异性.用美国InBios公司rK39试条进行平行检测,比较3种抗原检测的敏感性.结果 成功构建利什曼原虫pET32a-K26重组质粒,并在原核细胞中成功表达.以KS-6株、SC6株、JIASHI-1株利什曼原虫重组K26蛋白为包被抗原的ELISA法和rK39试条法检测黑热病患者血清的敏感性分别为 90.00％(99/110)、92.73％(102/110)、90.91％(100/110)和 93.64％(103/110),共检测 45 份其他寄生虫病患者(包括日本血吸虫病、疟疾、细粒棘球蚴病、华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和弓形虫病)的血清均无交叉反应,健康者血清(40份)也无假阳性反应,特异性均为100.00％.KS-6株、SC6株和JIASHI-1株利什曼原虫重组K26蛋白ELISA法和rK39试条法的阳性检出率差异无统计学意义(x2 KS-6=0.97,P=0.33;x2 SC6=0.07,P=0.79;x2 JIASH1-1=0.57,P=0.45).3种K26抗原的阳性检出率差异无统计学意义(x2=0.53,P=0.97).结论 重组K26抗原在内脏利什曼病诊断上具有潜在的应用价值.

目的:了解新设计的6组CpG分子在动物体内对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）重组亚单位疫苗免疫效果的提升作用，以初步筛选出有潜力的新型CpG佐剂。方法:通过序列检索比对，确定人鼠同源的CpG基序，以不同的组合方式设计出6条不同的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）序列，并人工合成相应6种CpG，分别与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用，已上市的佐剂CpG1018作为阳性对照。以间隔2周的方式免疫BALB/c小鼠2次，免疫后每周取眼眶血检测IgG1和IgG2a指标。2针免疫后21 d处死小鼠，取眼球血检测结合抗体抑制率；取脾脏淋巴细胞进行酶联免疫斑点试验检测。结果:初次免疫后14 d，CpG6组小鼠血清IgG2a和IgG1水平分别为3.63±0.27和3.44±1.03，显著高于CpG1018组的2.06±1.30和2.06±0.39。加强免疫后14 d，CpG6组小鼠血清IgG2a水平为6.52±0.21，高于CpG1018组的6.33±0.40。在针对原型株的结合抗体抑制率指标上，初次免疫14 d、加强免疫21 d后，各组间差异存在统计学意义（ F=13.66、12.58、19.38和19.38， P均<0.001）。初次免疫14 d后，稀释10倍血清中CpG6组小鼠血清抑制率为（64.67±20.41）%，高于CpG1018组[（27.84±20.23）%]，差异有统计学意义（ t=2.70, P=0.031）；加强免疫21 d后，稀释1 000倍的血清中CpG6组小鼠血清抑制率针对原型株[（89.71±4.83）%]和Delta株[（79.04±6.32）%]的抑制率水平均显著高于CpG1018组[（70.84±17.20）%和（52.61±14.22）%] ，差异有统计学意义（ t=2.36, P=0.046； t=3.80, P=0.005）。酶联免疫斑点实验结果显示，CpG1018组针对SARS-CoV-2原性株敏感和Delta突变株敏感的特异性IFN-γ分泌细胞数与CpG6组相比，差异均无统计学意义（ t=0.76， P=0.469； t=0.78， P=0.459）；在特异性IL-2分泌细胞数上，两组差异亦无统计学意义（ t=0.70， P=0.503； t=0.90， P=0.395）。 结论:CpG6与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用，能在疫苗初次免疫后更快速地在小鼠体内产生体液免疫应答，且加强免疫后体液免疫和细胞免疫效果均不弱于已上市的CpG1018佐剂。CpG6有望成为潜在的备选佐剂与疫苗联用。

目的:探讨1个家系中父源和母源人类白细胞抗原单体型 HLA- A/ C基因座之间的重组情况。 方法:选取2022年2月因"再生障碍性贫血"拟接受造血干细胞移植的1例患者作为研究对象。采集患者及其父母和胞兄的外周血样，分别采用测序和聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针技术对 HLA- A/ C/ B/ DRB1/ DQB1位点进行高分辨基因分型，通过家系分析确定个体的 HLA单体型。通过检测短串联重复序列位点确定家系成员之间的亲缘关系，再用二代测序技术对 HLA- A/ C/ B/ DRB1/ DRB345/ DQA1/ DQB1/ DPA1/ DPB1等11个位点进行高分辨分型，再次确认 HLA的重组位点。 结果:短串联重复序列位点结果证实家系成员之间存在亲缘关系。父源 HLA单体型 HLA- A* 24： 02 A* 33： 03/ C* 14： 03之间发生重组，母源 HLA单体型 HLA- A* 01： 01 A* 03： 01/ C* 08： 02之间发生重组，产生的新单体型被完整地遗传给子代。 结论:发现并证实了1个陕西汉族人群父源和母源 HLA- A/ C基因座位间同时发生重组的家系，为深入研究 HLA的重组机制提供依据。

目的:2016年冬季出现了一种重组型GII.2[P16]诺如病毒（norovirus，NoV），并造成了我国急性胃肠炎大规模暴发，本研究旨在探究2016—2017年该病毒在我国的进化动力学和时空传播模式。方法:利用MEGA 7.0和BEAST等软件对先前获得的暴发标本中GII.2[P16] NoV全基因组、主要结构蛋白（viral protein 1，VP1）和RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）基因全编码区序列进行分析。结果:序列分析显示此次重组型病毒VP1相比于RdRp基因的进化速度更快，在暴发中期，VP1蛋白的第256位出现了特异性氨基酸突变，即Val256Ile突变，且该突变位点形成的新型变异株在暴发后期成为优势流行株。基于该毒株P二聚体晶体结构的分析，发现该病毒VP1蛋白中第256位残基位点可能参与了B细胞抗原表位的组成，提示Val256Ile突变可能导致了新型变异株的抗原性发生改变，这可能是该病毒在暴发后期优势流行的原因之一，但需要进一步血清学实验的验证。基于贝叶斯地理推演结果显示，广东省可能为我国此次病毒流行的起源地，对该病毒在我国的暴发流行起了重要的作用。结论:鉴于出现功能性改变的GII.2[P16]新型变异株和广东省为我国该型病毒的暴发中心，提示有必要在珠江三角洲地区对GII.2[P16] NoV开展持续的监测和研究。

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法:对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后，利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测，根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后，将打靶载体电转H9细胞系，在 hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2，进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序，根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系，通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例，采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官，于分化后不同时间点行冰冻切片，免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。 结果:H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA，最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆，其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%，所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确，正常表达干细胞标志物，核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d，出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞，分化后45 d，出现RECOVERIN阳性光感受器细胞，分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层，水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层，光感受器细胞主要分布于顶层。结论:成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系，该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致，且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具，可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究，并促进致盲疾病治疗方法的开发。

目的:探讨人类免疫缺陷病毒感染/艾滋病(HIV/AIDS)患者接受高效抗反转录病毒治疗(HAART)过程中耐药的发生与多态性位点分布规律间的关系。方法:纳入2015年6月至2021年12月云南省16个地级行政区成功扩增得到pol区基因序列的HAART失败HIV/AIDS患者，采用人类免疫缺陷病毒(HIV)局部序列排比检索基本工具(BLAST)对序列进行亚型鉴定，MEGA 6.0软件进行亚型验证。将样本序列提交至美国斯坦福大学HIV耐药数据库进行耐药位点比对。分析不同耐药程度、治疗方案和HIV-1亚型患者的多态性位点分布情况。采用趋势 χ2检验分析不同耐药程度患者多态性位点出现频率变化趋势。统计学比较采用 χ2检验并作事后两两比较。 结果:1 453例患者扩增获得序列，耐药检测结果为敏感者954例，潜在或低度耐药者224例，中度耐药者189例，高度耐药者86例。随着HIV-1耐药程度的增加，HIV-1蛋白酶区(PR区)I15V、L19I、D60E和反转录酶区(RT区)E36A、T39D、S48T位点出现频率呈下降趋势( χ2趋势＝19.86、9.16、13.66、37.64、18.44、40.86，均 P<0.01)，PR区V77I和RT区K122E呈上升趋势( χ2趋势＝12.19、10.03，均 P<0.01)。齐多夫定+拉米夫定+洛匹那韦/利托那韦、齐多夫定+拉米夫定+依非韦伦、齐多夫定+拉米夫定+奈韦拉平和替诺福韦+拉米夫定+依非韦伦治疗组患者PR区E35D、M36I、D60E和RT区S48T、K122E、R211K位点的频率差异均有统计学意义( χ2＝22.46、9.32、14.46、26.85、18.92、24.26，均 P<0.05)。经两两比较，E35D、M36I、D60E位点在齐多夫定+拉米夫定+洛匹那韦/利托那韦组的频率，S48T在齐多夫定+拉米夫定+依非韦伦组的频率，K122E在齐多夫定+拉米夫定+奈韦拉平组的频率，以及R211K在替诺福韦+拉米夫定+依非韦伦组的频率分别高于其他3组，差异均有统计学意义(均 P<0.008)。流行重组型(CRF)08_BC、CRF07_BC和CRF01_AE亚型患者中PR区T12S、I15V、L19I、M36I、V77I、L89M和RT区E53D、I135V、S162C、R211K、K277R位点的频率差异均有统计学意义( χ2＝693.60、712.51、798.11、434.85、386.91、657.78、932.58、409.21、344.39、469.44、260.48，均 P<0.001)。经两两比较，T12S、I15V、L19I、E53D、I135V、S162C、R211K在CRF08_BC亚型中的频率，V77I和K277R在CRF07_BC亚型中的频率，以及M36I和L89M在CRF01_AE亚型中的频率分别高于其他2组，差异均有统计学意义(均 P<0.017)。 结论:HAART失败所产生的多态性位点在不同的耐药程度、治疗方案和HIV亚型等方面呈现出不同的分布特点，具有一定的特异性和共性，需加强对部分多态性位点的监测。

目的 克隆、表达驽巴贝虫精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(BcMC),鉴定其反应原性并分析其生物学信息.方法 根据驽巴贝虫部分基因序列设计并合成Bcmc基因扩增引物,采用PCR扩增Bcmc基因并克隆至原核表达载体pET-28a,提取质粒pET-28a-Bcmc进行双酶切、PCR和测序鉴定,将重组质粒转入感受态细胞大肠埃希菌BL21(DE3),优化诱导条件后,选择最适异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导温度和时间诱导,采用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况.用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后,以驽巴贝虫感染阳性马血清为一抗,Western blotting分析重组蛋白的反应原性.采用ProtParam等生物信息学在线软件预测Bcmc基因的理化性质、磷酸化位点、亚细胞定位、抗原表位、二级和三级结构、蛋白互作网络,对比BcMC与疟原虫属MC-1(PsMC-1)和泰氏锥虫MC(TtMC)的三级结构.Bcmc序列在NCBI上进行BLAST比对,使用Mega 7.0软件,采用邻接法构建基于mc基因序列的系统进化树.结果 Bcmc基因PCR扩增产物约为996 bp,与预期片段一致.重组质粒pET-28a-Bcmc经双酶切、PCR和测序鉴定表明插入的目的基因正确.诱导条件优化结果显示,BcMC重组蛋白在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、37 ℃培养5 h时的表达量最高.SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体的形式表达,相对分子质量(Mr)约为36 000.Western blotting结果表明,纯化后的BcMC可与驽巴贝虫感染阳性马血清发生特异性反应.生物信息学分析结果显示,BcMC的Mr为36 956.72;具有25个磷酸化点位;亚细胞定位预测位于线粒体的比例为10％;B细胞抗原表位分析发现该蛋白含有12个潜在抗原表位;BcMC蛋白的二级结构中,无规则卷曲占50.30％、α-螺旋占23.19％;BcMC的三级结构与PsMC-1和TtMC相似;蛋白互作网络预测结果显示,与BcMC相互作用的蛋白及BcMC参与的生物过程均与细胞凋亡有关.BLAST比对结果和系统进化树分析结果显示,Bcmc与马泰勒虫(CP099439)、马泰勒虫WA株(XM_004830992)的mc基因序列一致性均为99.90％,进化树上聚为一支,亲源关系较近.结论 BcMC原核表达蛋白具有良好的反应原性,生物信息学分析表明BcMC参与驽巴贝虫凋亡的生物过程.

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础.方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1.分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3.通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测.结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2 000 bp的基因片段,与预期大小相符.昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52 000,与预期相符.WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应.结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件.