目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。

目的:了解淡豆豉水煎液体外抗流感病毒作用，为抑制病毒的新型中药开发提供基础。方法:以A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)（以下简称PR8病毒）感染狗肾上皮细胞(MDCK)作为模型，应用噻唑兰(MTT)法评估淡豆豉水煎液的安全性。以血液凝集抑制实验和神经氨酸酶活性抑制实验检测淡豆豉水煎液对流感病毒吸附和释放的影响。设立PR8病毒+淡豆豉水煎液组和PR8病毒组，以实时荧光定量PCR、Western印迹试验、免疫荧光的方法检测淡豆豉水煎液对病毒基因转录水平和蛋白表达水平的影响。结果:6.25 mg/mL的淡豆豉水煎液能够抑制1 HAU流感病毒的吸附。PR8+淡豆豉水煎液组的子代病毒血凝效价为PR8组的1/8。2 000 μg/mL的淡豆豉水煎液能够抑制大于80%的神经氨酸酶活性。在第24小时，PR8+淡豆豉水煎液组的NP和M1基因转录水平分别为3 444.52±378.35和98 737.80±1 643.00；NP、M1a和M2e蛋白表达水平分别为0.39±0.03、0.54±0.01和0.82±0.02，均低于PR8组( t=-16.03、-16.17、-39.26、-272.80和-220.00， P均<0.05)。 结论:淡豆豉水煎液通过影响流感病毒生命周期的吸附、基因转录和翻译、流感子代病毒释放多个阶段，在体外发挥直接抗流感病毒作用。

目的:基于脂质多聚复合物(lipopolyplex, LPP)递送平台和保守抗原开发的新型流感病毒mRNA疫苗在小鼠体内的免疫原性评价。方法:将4个拷贝的甲型流感病毒基质蛋白2胞外域(extracellular domain of matrix 2 protein，M2e)与核蛋白(nucleoprotein，NP)编码基因按照真核密码子优化，串联构建融合抗原并体外转录为4M2eNP-mRNA，利用LPP技术平台制备甲型流感病毒mRNA疫苗(LPP-4M2eNP)。转染真核细胞后通过免疫荧光体外验证NP和M2e表达；BALB/c小鼠经肌肉注射10 μg、30 μg mRNA疫苗，间隔4周加强免疫一次，酶联免疫法检测免疫后血清抗体滴度，免疫斑点法检测细胞免疫应答。结果:间接免疫荧光检测表明4M2eNP-mRNA转染真核细胞后NP和M2e正确表达。单针免疫可明显诱导抗原(NP和M2e)特异性细胞免疫应答，加强免疫后在小鼠中诱发了抗原特异性体液免疫应答呈Th1型偏向；NP细胞免疫应答显著提高，但M2e细胞免疫应答强度无明显改变。结论:本研究制备的LPP-4M2eNP疫苗在小鼠中单针免疫即可诱导较强的细胞免疫应答，加强免疫后可诱导明显的体液和细胞免疫应答，表明该疫苗具有较好的研发和应用前景。

目的:阐明鲜冬虫夏草冷水提取物对香烟提取物(CSE)单一刺激以及复合流感病毒感染的体外抗炎作用。方法:用紫外高效液相色谱法分析鲜冬虫夏草冷水提取物核苷类成分，硫酸-苯酚法检测样品总糖含量，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测样品SOD活力。细胞活力检测试剂盒检测CSE和鲜冬虫夏草冷水提取物对人支气管上皮细胞(16HBE)和人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)的细胞毒性；以CSE刺激16HBE细胞48 h和THP-1细胞8 h建立炎症模型，加入不同浓度(1 000、500、250 mg/L)鲜冬虫夏草冷水提取物，用定量聚合酶链反应方法检测炎症因子mRNA的表达水平。在此基础上，构建CSE刺激48 h后感染甲型流感病毒24 h的16HBE细胞模型，以相同的方法评价药物对炎症因子mRNA表达的影响。最后，利用免疫荧光技术观察鲜冬虫夏草冷水提取物对CSE刺激16HBE致黏液蛋白5AC(MUC5AC)高分泌的抑制作用。结果:(1)鲜冬虫夏草冷水提取物总核苷含量为0.423%，总糖含量为18.69%，SOD活力为14 736.5 U/ml。(2)高、中浓度鲜冬虫夏草冷水提取物对CSE刺激16HBE细胞的白细胞介素6(IL-6)mRNA表达有明显抑制活性( t值分别为6.514、5.156， P值均<0.05)，高浓度可显著抑制MUC5AC的mRNA表达( t＝8.922， P<0.05)。(3)高、中、低浓度鲜冬虫夏草冷水提取物对CSE刺激THP-1细胞的肿瘤坏死因子α的mRNA表达均有明显抑制作用( t值分别为9.549、9.616、8.573， P值均<0.05)，对IL-6的mRNA的表达也均有抑制作用( t值分别为4.458、5.399、4.151， P值均<0.05)。(4)高浓度药物干预后，MUC5AC荧光在16HBE细胞胞浆的表达明显减少。 结论:鲜冬虫夏草冷水提取物在16HBE和THP-1细胞的炎症模型中显示出较好的抗炎活性，并且可抑制16HBE气道上皮细胞MUC5AC高分泌。本研究揭示了冬虫夏草兼具潜在治疗慢性阻塞性肺疾病炎症和黏液高分泌两大病理生理特征的药用特色。

目的:采用不同的流感病毒骨架构建表达分泌荧光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)的重组流感病毒，同时研究其生长特性、遗传稳定性、Gluc表达水平、体外抗流感药物活性。方法:在PR8NA的C端插入猪捷申病毒2A肽(porcine teschovirus-2A autocleavage peptide, P2A)自剪切位点及Gluc编码基因，其余7个质粒分别来源于A/Puerto Rico/8/34(PR8) (H1N1)和A/WSN/1933(WSN) (H1N1)，通过流感病毒反向遗传学8质粒系统拯救重组病毒，分别命名为PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN。检测重组病毒遗传稳定性；对比PR8NAGluc/PR8和PR8NAGluc/WSN的荧光强度；检测重组病毒的生长动力学；同时测定PR8NAGluc/WSN荧光强度与半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose，TCID 50)的相关性及对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟的体外抗流感药物活性。 结果:通过反向遗传学成功拯救出以PR8和WSN为骨架表达Gluc的重组病毒。相对于PR8骨架，以WSN为骨架明显提高了Gluc的表达且遗传稳定，复制动力学比野生型稍低。PR8NAGluc/WSN荧光强度与TCID 50有较好的相关性，其对奥司他韦、法匹拉韦和莲花清瘟具有良好的敏感性。 结论:以WSN为骨架的重组病毒荧光表达强度比PR8骨架高，为高通量筛选抗流感病毒药物及研发流感病毒载体疫苗提供参考。

本文报道1例42岁女性患者，主因"间断咳嗽、咳痰，伴进行性加重的呼吸困难"入院，病情进展快，早期行气管插管及体外膜肺氧合(ECMO)支持治疗，乙型流感病毒核酸阳性，多次痰培养及肺泡灌洗液培养检出曲霉菌，支气管镜检查示斑片状絮状物严重阻塞支气管，诊断为流感相关肺曲霉病。积极抗真菌治疗后撤离ECMO，之后再次出现氧合恶化行ECMO置管，最终患者因肺出血死亡。侵袭性肺曲霉病常见于严重免疫功能低下人群。免疫功能正常的人群可因流感病毒感染而继发曲霉菌感染。此类患者临床表现不典型，易误诊及漏诊。ECMO作为终极呼吸支持手段，可为疾病的诊断及治疗争取时间。维持适当范围凝血功能对预防肺出血起积极作用。反复评估肺通气功能与肺顺应性，有助于提高ECMO撤离的成功率。

中医参与救治1例在ICU抢救60 d的重症乙型流感合并重度急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的中年孕妇患者，其入院诊断为：(1)重症社区获得性肺炎(乙型流感病毒)：① ARDS(重度)；②感染性休克。(2)电解质紊乱：①低钾血症；②低钠血症。(3)孕24周。中医在抢救的第40天介入，此前对患者施以引产术，静脉-静脉体外膜肺氧合(veno-venous extracorporeal membrane oxygenation, VV-ECMO)联合间歇正压通气(IPPV)进行呼吸支持39 d，抗炎、抗休克、抗心衰等治疗。中医介入之时患者因血栓形成而撤下ECMO，炎症控制并不理想，呼吸频率50～60次/min，仍面临生命危险，以中医针药并用，当日呼吸频率降至36次/min。中医介入第3日体温恢复正常，呼吸频率降为日均22次/min；第8日可经口进食，开始撤呼吸机；第21日患者由ICU转出至普通病房；第32日痊愈出院。提示抢救危重症患者，需中西医并用；危重症阶段扶助正气是中医的优势；针灸在急危重症抢救中的重要作用不容忽视。

目的 在细胞水平观察桑藿排毒茶对甲型H1N1 流感病毒的抑制作用.方法 利用CCK-8 试剂检测桑藿排毒茶的细胞毒性,通过分析不同处理组中甲型流感病毒RNA与蛋白表达水平的变化,评价该组方抗甲型流感病毒活性的高低.结果 桑藿排毒茶与磷酸奥司他韦对犬肾细胞(MDCK)的最大无毒浓度(TC0)分别为4.32、1.02 mg·mL-1,半数有效浓度(EC50)分别为 0.38 mg·mL-1、3.5 μg·mL-1.在Q-PCR与Western blotting试验中,相较于病毒组,经药物处理后的感染细胞中流感病毒RNA与蛋白的表达量均显著降低,说明其对病毒的抑制作用较强.结论 桑藿排毒茶在细胞水平可以抵抗甲型流感病毒感染,具有进一步开发意义.

目的 探索土木香内酯体内外的抗病毒作用,并基于Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)通路探究其抗病毒作用机制.方法 CCK-8法检测土木香内酯对A549细胞活力的影响;利用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein,VSV-GFP)感染细胞模型,结合流式细胞术检测土木香内酯对病毒复制的影响;qRT-PCR检测土木香内酯对甲型流感病毒(influenza A virus,H1N1)、脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)复制的影响;Western blotting检测土木香内酯对VSV病毒G蛋白和H1N1病毒NP蛋白表达的影响;利用生物信息学初步分析土木香内酯的抗病毒分子机制;qRT-PCR检测药物处理后干扰素α1(interferon α1,Ifna1)、干扰素β1(interferonβ1,Ifnb1)、干扰素诱导蛋白1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1,Ifit1)、干扰素刺激基因 15(interferon stimulated gene 15,Isg15)的mRNA表达变化;流式细胞术和qRT-PCR检测 Ⅰ型干扰素受体1(type Ⅰ interferon receptor 1,IFNAR1)敲除(Ifnar1-/-)细胞中,土木香内酯的抗病毒作用与干扰素信号通路的关系;构建小鼠H1N1病毒滴鼻感染模型探究土木香内酯的体内抗病毒作用.结果 土木香内酯体外抑制VSV、H1N1和EMCV病毒复制;土木香内酯激活IFN-Ⅰ信号通路;在Ifnar1-/-细胞中土木香内酯抗病毒作用被削弱;土木香内酯提高H1N1感染小鼠的存活率,降低脏器H1N1病毒载量.结论 土木香内酯激活基于IFN-I信号通路的抗病毒天然免疫反应,发挥抵抗多种病毒复制的作用.