目的 运用网络药理学结合实验验证研究冯了性风湿跌打药酒治疗类风湿关节炎的作用机制.方法 借助前期研究中超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术分析冯了性风湿跌打药酒的活性成分,通过 TCMSP 数据库、Swiss Target Prediction数据库筛选活性成分靶点,Drugbank、OMIM、GeneCards、TTD、Disgenet数据库检索类风湿性关节炎的疾病靶点.利用STRING数据库绘制蛋白相互作用(PPI)网络图,分析冯了性风湿跌打药酒治疗类风湿关节炎的核心靶点.通过DAVID数据库进行基因本体(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,预测其富集的信号通路并进行可视化展示.利用 AutoDockTools 1.5.6 软件进行分子对接.利用牛Ⅱ型胶原乳剂诱导建立类风湿关节炎大鼠模型,进行关节炎评分,组织病理学检查,PCR分析关键基因mRNA表达水平,ELISA法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和白细胞介素-6(IL-6)水平.结果 冯了性风湿跌打药酒中 46 个核心化学成分对应靶点 661 个,搜索收集获得疾病靶点2604个,两者交集后获得283个冯了性风湿跌打药酒治疗类风湿关节炎的潜在靶点.分析得到蛋白激酶B1(Akt1)、肿瘤蛋白p53(TP53)、血管内皮生长因子A(VEGFA)等 10 个核心靶点,10条GO相关条目及 15条KEGG通路,关键通路包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信号通路、Ras信号通路、Rap1 信号通路、HIF-1 信号通路等.分子对接结果表明,秦皮乙素、5,7-二羟基香豆素、东莨菪苷核心成分与Akt1、HIF-1α核心靶点均具有良好的结合能力.动物实验结果显示,冯了性风湿跌打药酒可以缓解类风湿关节炎大鼠的关节肿度,降低关节指数,HE染色结果显示冯了性风湿跌打药酒减轻滑膜增生、软骨退化,PCR结果表明冯了性风湿跌打药酒显著降低HIF-1α mRNA水平,ELISA实验结果显示冯了性风湿跌打药酒显著降低IL-6、HIF-1α水平.结论 利用网络药理学分析,初步揭示了冯了性风湿跌打药酒可能作用于Akt1、PI3K等靶点干预类风湿关节炎的疾病进程,结合药效学实验,发现冯了性风湿跌打药酒可能是通过降低IL-6、HIF-1α,对类风湿关节炎起到治疗作用.

目的:建立冯了性风湿跌打药酒的高效液相(HPLC)指纹图谱,并测定其中10种有效成分的含量.方法:采用HPLC法.色谱柱为Inertsil ODS-3 C18,流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(梯度洗脱),流速为1.0 mL/min,柱温为25℃,检测波长为210 nm(10～15 min,盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱)、300 nm(70～120 min,桂皮醛)、345 nm(15～70 min,新绿原酸、东莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯、异绿原酸A、异绿原酸C),进样量为10μL.以东莨菪内酯峰为参照,绘制10批样品的HPLC指纹图谱,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行相似度评价,确定共有峰.结果:10批样品共有18个共有峰,相似度均大于0.980,共指认出盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、新绿原酸、东莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯、异绿原酸B、柚皮苷、异绿原酸A、异绿原酸C、桂皮醛等12个成分.盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、新绿原酸、东莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯、异绿原酸A、异绿原酸C、桂皮醛等10个成分检测质量浓度的线性范围分别为2.475～247.5、2.600～260.0、3.820～382.0、3.900～390.0、3.060～306.0、4.760～476.0、4.540～454.0、4.900～490.0、4.540～454.0、7.590～759.0μg/mL(r均大于0.9990);定量限分别为0.3200、0.3500、0.0214、0.0243、0.0368、0.0257、0.1521、0.0429、0.0251、0.3503μg/mL,检测限分别为0.1600、0.1800、0.0079、0.0040、0.0012、0.0073、0.0760、0.0014、0.0081、0.2014μg/mL;精密度、重复性、稳定性试验的RSD均小于2％;加样回收率为95.03％～106.85％(RSD为0.67％～2.68％,n=6);上述10种成分的含量分别为0.0133～0.2141 mg/mL.结论:所建指纹图谱稳定、准确、专属性强,可用于冯了性风湿跌打药酒的质量控制;含量测定方法简便快速、准确可靠,可用于同时测定其中10种有效成分的含量.

目的 建立HPLC法同时测定冯了性风湿跌打药酒中新绿原酸、东莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的含量,为冯了性风湿跌打药酒的质量控制提供参考.方法 采用Agilent 5 TC-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),乙腈-0.1％磷酸作流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,柱温25℃,检测波长345 nm.结果 新绿原酸、东莨菪苷、绿原酸、隐绿原酸、东莨菪内酯、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C分离度良好且分别在0.86～86.00、1.28 ～ 128.00、1.10～ 110.00、0.72 ～ 72.00、0.86～86.00、2.18～218.00、1.34 ～ 134.00、1.76～ 176.00μg·mL-1范围内呈良好的线性关系(r≥0.9998);8种成分的平均加样回收率在97.78％ ～ 101.45％之间,RSD在0.95％～1.90％之间.结论 该方法简便、准确,分离效果好,重复性好,可用于冯了性风湿跌打药酒的质量评价.

目的:鉴定冯了性风湿跌打药酒的化学成分.方法:采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术(UPLC-Q-Exactive-MS).色谱柱为Thermo Accucore aQ RP18,流动相为0.1％甲酸水溶液-甲醇(梯度洗脱),流速为0.3 mL/min,柱温为30℃,进样量为2μL.离子源为加热电喷雾离子源;离子模式为正、负离子模式;鞘气、辅助气为氮气;正离子模式的喷雾电压为3.5 kV,毛细管加热温度为350℃,鞘气压力为35 psi,辅气压力为15 arb,离子源加热温度为320℃;负离子模式的喷雾电压为3.2 kV,毛细管加热温度为350℃,鞘气压力为35 psi,辅气压力为15 arb,离子源加热温度为300℃.质量轴校准为外标法(质量误差小于5 ppm),一级质谱扫描范围为m/z 80.0～1200.0(分辨率为70000),二级质谱扫描范围为m/z 80.0～1200.0(分辨率为17500),碰撞电压为20、40、60 eV.检索中国知网、维普、PubMed等数据库,收集冯了性风湿跌打药酒中各味中药材的化学成分信息,建立化学成分数据库;结合上述成分数据库、相关文献以及对照品的保留时间和质谱裂解规律对化合物结构进行鉴定.结果 与结论:从冯了性风湿跌打药酒中共鉴定出59种化合物,包括12种黄酮类(如圣草枸橼苷、橙皮苷)、8种生物碱(如包公藤丙素或凹脉丁公藤碱、麻黄碱、伪麻黄碱)、9种有机酸类(如绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸)、7种香豆素类(如花椒毒酚)、4种酯类、4种氨基酸类和15种其他类(如挥发油、萜类、酰胺类等).UPLC-Q-Exactive-MS技术可快速、准确地鉴别冯了性风湿跌打药酒中的化学成分.

目的 快速鉴别丁公藤、大果飞蛾藤投料的冯了性风湿跌打药酒,并探讨成分差异导致的药酒抗风湿药效差异.方法 建立冯了性风湿跌打药酒HPLC指纹图谱,结合主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)发掘不同投料药酒的快速鉴别方法.对差异性成分进行网络药理学研究,探讨成分差异导致的抗风湿药效差异.结果 9批样品共标定29个共有峰,通过对照品比对指认其中11个峰,采用PCA及PLS-DA得到3种差异性成分和1种专属性成分,实现不同投料药酒的快速鉴别.差异性成分新绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸B主要作用于MAPK、TNF、Chemokine、Toll-like信号通路发挥抗风湿作用.结论 该方法可实现以丁公藤、大果飞蛾藤投料的冯了性风湿跌打药酒的快速鉴别,提升冯了性风湿跌打药酒质量控制水平.