目的 以检测出血性大肠埃希菌(EHEC)0157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法.方法 根据出血性大肠埃希菌O157∶H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RPA检测方法.结合SYBR Green Ⅰ在核酸反应中的颜色变化特征,设计可视化RPA检测方法.结果 建立的实时荧光RPA检测方法和可视化RPA检测方法,分别在35 ℃时反应不超过25 min即可检测EHEC O157∶H7.设计的引物和探针仅对EHEC O157∶H7出现特异性结果.两种检测方法的检测限低于10-5 ng/μL.结论 EHEC O157∶H7的可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法操作简便,且特异性强、敏感性高,可为EHEC O157∶H7的现场快速检测和实验室检测提供新方法.

目的 通过流行病学调查与病原菌鉴定,并结合既往相关菌株资料,对2016年6月上海市腹泻病综合监测中报告的1例肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7感染病例进行病原学分析.方法 对患者开展流行病学调查.采集标本后进行菌株分离培养、生化鉴定并确定血清型;利用聚合酶链式反应(PCR)检测所携带的毒力基因;采用微量肉汤稀释法进行药敏试验;应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行分子分型;通过全基因组测序获取序列信息进行多位点序列分型(MLST)及单核苷酸多态性分析.结果 流行病学调查未发现可疑传染源.患者样本分离出EHEC O157:H7;携带eae、stx2基因;对进行试验的16种抗生素均敏感;菌株图谱带型与以往监测中分离菌株带型均不相同;MLST分型为ST11型,与以往分离菌株核心基因组差异较大.结论 上海市较长时间无检出EHEC O157:H7菌株的病例记录,通过对此次分离的菌株的全面检测,确定了其毒力基因、耐药性和MLST型别,并发现新的PFGE带型,其核心基因组与以往菌株呈现出一定差异,值得进一步关注.

目的 利用λRed重组系统构建肠出血型大肠埃希菌O157∶H7 espG基因缺失株,并研究其生物特性,对EspG蛋白进行初步生物信息学分析. 方法 设计并合成一对同源臂引物,每条引物5'端与espG基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源,扩增卡那霉素抗性基因片段,制备含有pKD46质粒的EHEC O157∶H7 EDL933w感受态细菌.将该抗性基因片段电击转化入制备的感受态菌株中,利用pKD46介导的Red重组系统,通过同源重组替换EHEC O157∶ H7EDL933w espG基因,经PCR和测序验证后,通过革兰染色、测A.值、姬姆萨染色比较EHEC O157∶ H7 EDL933w野生株(Wild type,WT)与突变株的形态结构、生长能力和黏附性的差异性.以EDL933w菌株为研究对象,用在线软件VaxiJen v2.0对EspG蛋白抗原性进行评分,在ProParam软件中分析EspG蛋白序列的基本理化性质,利用SOPMA软件进行二级结构预测,采用SWISS-Model预测三级结构,通过Bcepred软件对EspG蛋白序列B抗原表位进行预测分析. 结果 PCR及序列分析证实构建了espG基因缺失并含有卡那霉素抗性的EHEC O157∶ H7 EDL933w突变菌株,野生株与突变株均为革兰染色阴性短棒状杆菌,野生株对Caco2细胞的黏附率明显高于突变株(P＜0.01).应用Bcepred等软件对EspG蛋白表位参数综合分析,预测到10条B细胞潜在优势抗原表位. 结论 构建了肠出血型大肠埃希菌O157∶H7 espG基因缺失株,探索了EHEC O157∶H7 EDL933w野生株与突变株的生物学特性,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌LEE毒力岛中espG基因的调控机制提供实验基础.明确了EspG蛋白二三级结构以及其生物信息学特性,为优势表位的鉴定和筛选奠定了基础.

[背景]肠出血性大肠埃希菌O157∶H7是重要的食源性致病菌之一,并且其耐药性越来越严重,寻找裂解性强噬菌体用于防治大肠埃希菌感染具有广阔的应用前景.[目的]从环境中分离鉴定能特异裂解大肠埃希菌O157∶H7的噬菌体,通过对生物学特性及裂解细菌功效的探究,为其在食品安全防控中提供理论依据和研究基础.[方法]通过双层平板法分离并纯化噬菌体,透射电镜观察噬菌体形态,测定最佳感染复数、一步生长曲线、pH稳定性、温度稳定性,对噬菌体进行全基因组测序及噬菌体裂解细菌功效.[结果]2株大肠埃希菌O157∶H7噬菌体FEC14和FEC19的头部皆呈二十面体立体对称,FEC14头部直径约80 nm,尾丝呈星形,FEC19头部直径约58nm,尾丝呈针形;噬菌体FEC14的最佳感染复数为0.001,潜伏期为15 min,裂解期为65 min,平均暴发量为156PFU/cell,FEC19的最佳感染复数为0.1,潜伏期为10min,裂解期为80min,平均暴发量为800 PFU/cell;噬菌体FEC14能在60℃、pH 4.0-11.0条件下存活,噬菌体FEC19在 70℃、pH 5.0-9.0 条件下存活;FEC14 归类于有尾目(Caudovirales)Ackermannviridae 科Kuttervirus 属,FEC19 归类于有尾目(Caudovirales)肌尾科(Myoviridae)Wifcevirus 属;单一噬菌体或混合鸡尾酒法均能降低染菌牛肉中的细菌数量,并且未发现已知毒力基因和耐药基因,能控制大肠埃希菌O157∶H7的污染.[结论]2株大肠杆菌O157∶H7噬菌体FEC14和FEC19特异性高、稳定性强、裂解效率高,在控制食品中大肠埃希菌O157∶H7污染的应用中具有很大潜力,将来可以开发为食品防控制剂用于食品加工各个领域.

目的 建立一种重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测志贺菌.方法 依据志贺菌属侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因的保守序列设计特异性引物,建立RPA检测方法;通过检测梯度稀释的志贺菌标准菌株DNA,评价RPA的灵敏度;通过检测志贺菌、出血性大肠埃希菌O157∶H7、沙门菌、副溶血弧菌、粪肠球菌评价RPA的特异性.结果 建立的RPA方法在35℃反应20 min,即可检测到志贺菌ipaH基因,检测灵敏度为10-5 ng/μl志贺菌基因组DNA,比PCR高100倍;且与其他肠道病原菌无交叉反应.结论 本研究建立的志贺菌RPA检测方法敏感性、特异性强,操作简单快速,为志贺菌的现场快速检测提供一种新思路.

目的 分析福建省疾控中心微生物检验科实验室致泻大肠埃希菌的质控考核结果,总结经验,促进监测工作质量提高及防控疫情暴发中实验室检测的作用.方法 福建省CDC微生物检验科实验室于2014-2016年参加4次国家相关部门组织的致泻大肠埃希菌考核,依据每次考核作业指导书及相关国家标准要求选择检测方法,对考核株进行分离培养、生化鉴定、血清分型及多重PCR或荧光多重PCR基因检测.结果 各考核结果均获满意,考核株均为肠出血性大肠埃希菌,但血清型有些不同,包括O55∶H7、O157∶H7、O26∶H11,检出毒力基因存在uidA、escV、eae、stx1、stx2的不同组合.结论 福建省CDC微生物检验科实验室质控考核结果,具备致泻大肠埃希菌检测能力.随着病原的变异,今后应加强产志贺毒素大肠埃希菌亚型分型能力及其他类致泻大肠埃希菌的考核.