目的:建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法:针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针，优化反应温度，建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术，评价其特异性和敏感性，并与Real time PCR方法进行比较。结果:该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL，与其他流感/禽流感病毒无交叉反应，反应可在20~50℃温度范围内进行，临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0％。结论:该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点，为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。

[目的]鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节.通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法.[方法]基于MG的mgc2 基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针,优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法,评价其灵敏度、特异性、稳定性,同时对 120 份临床样品进行检测.[结果]双重LFD-RPA检测方法在 37℃下反应 5-10 min即可完成扩增,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1 最佳引物配比为 0.6∶1.4.MG、MS的最低检出限分别为 3.75 copies/μL、3.46 copies/μL.用该方法与OIE推荐的PCR方法对 120 份样品进行检测,二者符合率为 93.3%.[结论]MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增,其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好,无需使用任何仪器即可观察到结果,适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测.

目的 探讨并建立非专业实验室场景下恒温、快速及简便的检测副溶血性弧菌的方法.方法 本研究针对副溶血性弧菌toxR基因设计特异性引物和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA),建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR及其相关蛋白13a(CRISPR-Cas13a)的反应体系,采用自配十二烷基硫酸钠(SDS)核酸快速提取试剂提取样本全基因组,并结合荧光法实现检测结果的可视化判读.结果 利用副溶血性弧菌菌株ATCC 17802和其他3种非副溶血性弧菌(溶藻弧菌、河流弧菌和梅氏弧菌)以及3种临床上常见腹泻致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)对RPA-CRISPR/Cas13a荧光法的特异性进行验证,结果显示特异性为100.00％;对副溶血性弧菌基因组DNA进行倍比稀释并检测,该方法最低检出限为102 copies/μl.最后,将建立的方法应用于野生型副溶血性弧菌检测,检测结果与TaqMan定量聚合酶链式反应(TaqMan-qPCR)检测结果及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定结果一致.结论 本研究建立了一种针对toxR基因的RPA-CRISPR/Cas13a检测方法,具有简便、快速、特异性强、结果判读可视化等优点,为非专业实验室场景下的副溶血性弧菌快速检测提供了较好工具.

目的 以检测出血性大肠埃希菌(EHEC)0157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法.方法 根据出血性大肠埃希菌O157∶H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RPA检测方法.结合SYBR Green Ⅰ在核酸反应中的颜色变化特征,设计可视化RPA检测方法.结果 建立的实时荧光RPA检测方法和可视化RPA检测方法,分别在35 ℃时反应不超过25 min即可检测EHEC O157∶H7.设计的引物和探针仅对EHEC O157∶H7出现特异性结果.两种检测方法的检测限低于10-5 ng/μL.结论 EHEC O157∶H7的可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法操作简便,且特异性强、敏感性高,可为EHEC O157∶H7的现场快速检测和实验室检测提供新方法.

目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法.方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物.通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对.根据最佳引物对,设计探针和修饰引物.在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系.根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件.使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性.以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度.收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价.结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果.该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强.应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致.与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性.结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌.该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力.

目的 国标标准规定清洁级和SPF级小鼠必须排除仙台病毒(Sendai virus,SeV).为了提升效率,简化操作步骤,本研究建立了一种新型分子检测方法——实时荧光重组酶等温扩增技术(real-time RPA)用于检测SeV.方法 针对SeV融合蛋白编码基因的保守序列,设计特异性扩增引物及探针并建立检测方法,并评价该检测方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性.最后将该检测方法和团标PCR方法进行优势比较.结果 该方法具有很好的特异性,与小鼠肝炎病毒等六种病原微生物无交叉反应.其敏感性、稳定性和可靠性均可,并能够在25 min内完成,远远快于PCR方法.结论 本研究建立的SeV实时荧光RPA是一种操作简单,高效直观且特异性好的检测方法.

目的 重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的传统检测方法 因操作繁琐等因素,不适于现场快速检测.以乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测为例,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的HBV核酸等温扩增检测方法 并设计了配套的RPA产物可视化检测装置.方法 首先设计了可用手机拍照采集图像并经肉眼可视化判读检测结果 的RPA产物检测装置;然后根据HBV基因保守序列设计RPA引物及探针,通过监测RPA反应的实时荧光曲线来比较各引物对的扩增效率来筛选最佳引物对并优化最适的反应条件,采用人工合成的HBV靶标质粒考察可视化检测的灵敏度,并通过检测人工合成的包含丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体、流感病毒、人乳头瘤病毒核酸片段的质粒来考察了方法 的特异性;通过与实时荧光扩增曲线进行对比,验证了RPA产物可视化检测装置的可行性;最终对20份经实时荧光PCR检测过的血清DNA样本进行RPA可视化检测来评价方法 对临床实际样本检测的适用性.结果 采用RPA产物可视化检测装置实现了手机拍照肉眼观察即可判定检测结果 的阴阳性信号,HBV核酸RPA扩增可视化检测方法 可在39 ℃ 30 min内实现对低至1-10拷贝HBV DNA靶标的可视化检测,并且特异性良好;对20份血清DNA样本检测的结果 与市售qPCR试剂盒的检测结果 完全一致,初步验证了方法 及装置的实用性.结论 基于建立的HBV-RPA扩增体系,结合配套设计的RPA产物可视化检测装置,有望开发出低成本血液HBV核酸现场快速可视化筛查技术平台.

目的 结合重组酶聚合酶扩增(RPA)技术及侧流层析试纸条法(LFD)建立日本血吸虫特异核酸片段的快速可视化检测方法,并初步评价其检测日本血吸虫感染小鼠血清中血吸虫循环核酸的应用价值. 方法 以日本血吸虫非长末端重复序列逆转录转座子SjCHGCS19为靶标,设计RPA引物和探针,以日本血吸虫基因组DNA为模板进行RPA及LFD检测,并优化RPA反应温度及时间,建立日本血吸虫核酸RPA-LFD快速可视化检测方法.用RPA-LFD检测模板量为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7 ng的日本血吸虫基因组DNA,评价其敏感性;用RPA-LFD方法检测日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫基因组DNA,评价其特异性.制备含0.01、0.1、1、10和100 ng日本血吸虫成虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清.用40条日本血吸虫尾蚴感染小鼠,采集并分离感染前及感染后7、21、35 d小鼠尾静脉血清.提取模拟阳性鼠血清、感染小鼠血清样品中的循环DNA,评价RPA-LFD检测血清中血吸虫特异核酸的可行性及其早期检测价值. 结果 建立了快速可视化检测SjCHGCS19重复序列的RPA-LFD方法,30～45℃反应10 min即可检出目的片段.RPA最优反应条件为39℃,20 min.RPA-LFD对日本血吸虫成虫基因组DNA的最低检出限为10-6 ng(1fg).特异性评价结果显示,RPA-LFD检测曼氏血吸虫和埃及血吸虫基因组DNA结果为阳性,检测卫氏并殖吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果为阴性.RPA-LFD方法可成功检出含0.01～100 ng日本血吸虫基因组DNA的模拟阳性鼠血清以及血吸虫感染后7、21、35 d鼠血清中的游离SjCHGCS19 DNA片段. 结论 建立了一种快速、可视化检测日本血吸虫循环核酸的RPA-LFD方法,该方法敏感性高,具有检测血吸虫早期感染的潜在应用价值.

转基因玉米双抗12-5具有良好的抗虫性和除草剂耐受性,是我国第一批获得安全证书的转基因玉米之一,具有广阔的应用前景.本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)建立转基因玉米双抗12-5的现场快速检测方法.针对转基因玉米双抗12-5的转化体特异性序列片段,设计引物和探针,通过引物筛选实验得到最佳引物与探针组合.荧光RPA扩增结果可以在蓝光下直接进行可视化分析.结果表明,建立的转基因玉米双抗12-5可视化检测体系特异性强,检测灵敏度达到10拷贝.进一步研究发现RPA的扩增体系对温度有很强的适应性,样品在34℃～46℃之间都能得到扩增,据此,本研究利用市面上常见的自发热暖贴代替常规的加热仪器来激发RPA.结果表明,自发热暖贴满足RPA扩增体系对温度的需要.最终,本研究将自发热暖贴加热法与RPA可视化检测体系结合,对转基因玉米双抗12-5进行现场检测,并与qPCR方法检测结果作比较,检测结果表明,本研究建立的现场可视化检测方法与qPCR方法检测结果一致,并且可视化检测方法时间短,检测结果清晰易分辨.本研究建立的转基因玉米双抗12-5现场快速可视化检测方法,其特异性强、灵敏度高、方便、快捷,不仅满足了转基因玉米双抗12-5的现场快速检测的需要,也为其他现场快速检测方法的开发提供了新思路.

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase ploymerase amplication,RPA)是一种新型恒温核酸扩增技术,与PCR相比,操作简便,反应快速,灵敏度高,特异性强,无需精密仪器,是一种可以替代PCR的核酸检测技术,被认为是目前最有潜力成为快速分子诊断的工具.RPA与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)结合的RPA-LFD技术,可实现扩增产物的可视化检测,在病原体现场核酸快速检测中具有良好的应用前景,这为实验动物的质量监督检验提供了一种新的方法.本文对RPA-LFD这一新型核酸检测方法的技术原理、研究现状、技术瓶颈及用于现场核酸提取的研究进展进行综述.