目的 以检测出血性大肠埃希菌(EHEC)0157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法.方法 根据出血性大肠埃希菌O157∶H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RPA检测方法.结合SYBR Green Ⅰ在核酸反应中的颜色变化特征,设计可视化RPA检测方法.结果 建立的实时荧光RPA检测方法和可视化RPA检测方法,分别在35 ℃时反应不超过25 min即可检测EHEC O157∶H7.设计的引物和探针仅对EHEC O157∶H7出现特异性结果.两种检测方法的检测限低于10-5 ng/μL.结论 EHEC O157∶H7的可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法操作简便,且特异性强、敏感性高,可为EHEC O157∶H7的现场快速检测和实验室检测提供新方法.

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是一种由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性、高度传染性疾病,主要感染山羊和绵羊,发病率和死亡率极高.由于其严重的病理损害及广泛的传播性,给各国养殖业及国际贸易造成巨大经济损失,因此,建立快速、准确的检测方法对该病的防控尤为重要.本文就用于 PPRV检测的普通 RT-PCR、普通多重 PCR、实时荧光定量PCR(real-time fluorence quantitative PCR,RT-qPCR)、焦磷酸光化测序、巢式PCR(nested PCR,nPCR)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)等生物检测技术的研究进展作一综述,以期为科学检测、鉴定PPRV提供依据和思路.

目的 建立一种优化的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法,用于临床快速检测铜绿假单胞菌. 方法 (1)提取1株铜绿假单胞菌标准菌株DNA模板,采用PCR、实时荧光定量PCR和RPA进行检测,统计3种方法检测的加样时长、扩增时长和检测时长.(2)取1株铜绿假单胞菌标准菌株,复苏摇菌后逐次稀释为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1 ×102、1×101集落形成单位(CFU)/mL7个浓度梯度,以恶臭假单胞菌为阴性对照,分别提取DNA模板,进行RPA、实时荧光定量PCR及PCR,分析3种方法检测铜绿假单胞菌的灵敏性.(3)取1株铜绿假单胞菌标准菌株和4株阴性对照菌(金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、白色念珠菌和恶臭假单胞菌),分别提取DNA模板,行RPA、实时荧光定量PCR及PCR,分析3种方法检测铜绿假单胞菌的特异性.(4)取28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株、1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株,以恶臭假单胞菌为阴性对照,分别提取DNA模板,行RPA.观察上述菌株是否出现阳性扩增信号,并计算其检出率.所有实验重复3次.采用GraphPad Prism 5.01统计软件对灵敏性结果进行分析. 结果 (1)RPA、PCR和实时荧光定量PCR检测铜绿假单胞菌的加样时间均为20 min,其中PCR扩增98 min,凝胶检测20 min,共计138 min;实时荧光定量PCR扩增和检测可同步完成,需90 min,共计110 min;RPA中扩增和检测也可同步完成,需15 min,共计35 min.(2)3种检测方法中恶臭假单胞菌均未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果.实时荧光定量PCR和PCR中铜绿假单胞菌检测下限为1×101 CFU/mL,RPA中铜绿假单胞菌检测下限为1×102 CFU/mL.RPA、实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌浓度越高,出现阈值时间越短、循环数越少,即检测到阳性扩增信号的时间越短.实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌浓度为1×101～1×107 CFU/mL时,均能检测到阳性扩增信号.RPA中,铜绿假单胞菌浓度为1×101 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为0;浓度为1×102 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为67％;浓度为1×103～1×107 CFU/mL时,其阳性扩增信号检出率为100％.(3)RPA、PCR和实时荧光定量PCR中,铜绿假单胞菌出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果,鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及恶臭假单胞菌4种阴性对照菌未出现阳性扩增信号和凝胶阳性结果.(4)RPA中,28株甘油保存的铜绿假单胞菌临床菌株及1株棉拭子取材的铜绿假单胞菌临床菌株均出现阳性扩增信号,恶臭假单胞菌未出现阳性扩增信号;29株临床铜绿假单胞菌阳性扩增信号检出率为100％.结论 本研究建立的优化的铜绿假单胞菌RPA快速检测方法,耗时短,灵敏性及特异性强,对临床快速检测铜绿假单胞菌感染具有重要应用价值.

目的 建立一种基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification RPA)快速鉴定鲍曼不动杆菌的实时荧光检测方法 . 方法 根据鲍曼不动杆菌16S-23S rRNA ITS基因特异保守序列设计RPA引物与探针,采用铜绿假单胞菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌4种非鲍曼不动杆菌作为对照进行鲍曼不动杆菌实时荧光RPA特异性验证;对菌液进行梯度稀释后提取模板,验证方法的灵敏性;采用RPA检测30株鲍曼不动杆菌临床分离株,以验证方法 的临床应用性. 结果 建立的RPA扩增方法 在42 ℃条件下18 min内完成对鲍曼不动杆菌的快速检测,与对照菌相比,仅鲍曼不动杆菌呈现典型的扩增曲线;RPA检测鲍曼不动杆菌最低检出限为2.86 cfu/ml菌液,与PCR及实时荧光PCR结果一致.30株鲍曼不动杆菌临床分离株RPA检测均出现扩增曲线,检出率为100％. 结论 建立的鲍曼不动杆菌实时荧光RPA方法具有高特异、灵敏、简便、迅速等优点,可用于鲍曼不动杆菌感染快速检测.

目的 探讨实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)在白色念珠菌检测中的初步应用效果.方法 (1)取1 mL白色念珠菌标准株及阴性对照菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、光滑念珠菌标准株菌液,使用酵母/细菌基因组试剂盒提取DNA.分析PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠菌的特异性.(2)取1株白色念珠菌标准株,以光滑念珠菌为阴性对照菌,复苏摇菌并计数,10倍倍比稀释为1×107～1×101集落形成单位(CFU)/mL,同实验(1)提取DNA,分析PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠球菌的灵敏性.统计实时荧光定量PCR扩增曲线达到阈值所需循环数及实时荧光RPA出现特异性扩增曲线所需时间,并与PCR结果进行比对.统计3种方法对白色念珠菌的检出下限及检出率,分析实时荧光RPA中白色念珠菌浓度与检测时间之间的相关性.(3)取1株白色念珠菌标准株,同实验(1)提取DNA,分别行PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA,统计3种方法检测总时长.(4)取31份疑似感染白色念珠菌的临床样本和1份棉拭子取材的白色念珠菌临床样本提取DNA,进行PCR与实时荧光RPA,统计阳性检出率.分别采用酵母/细菌基因组试剂盒、chelex-100加热煮沸法、液氮反复冻融法提取上述2种方法检测均出现阳性结果的临床样本的DNA.同前行实时荧光RPA检测(以光滑念珠菌为阴性对照菌)和PCR检测,阴性对照菌同实验(1),观察2种方法检测是否出现阳性结果,并统计实时荧光RPA中扩增曲线达到荧光阈值所需时间.对数据行线性相关分析和t检验. 结果 (1)3种方法检测中白色念珠菌均出现阳性结果,5种阴性对照菌均未出现阳性结果.(2)白色念珠菌菌液浓度越低,实时荧光定量PCR中扩增曲线达到阈值所需循环数越多,实时荧光RPA中出现特异性扩增曲线所需时间越长,PCR中凝胶条带的亮度越弱,3种检测方法中阴性对照菌均未出现相应的阳性结果.实时荧光RPA、PCR与实时荧光定量PCR中白色念珠菌的检出下限均为1×101 CFU/mL.实时荧光RPA中白色念珠菌浓度与检测时间呈明显负相关,r=-0.95,P＜0.01.PCR与实时荧光定量PCR对1×101～1×107 CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率均为100％.实时荧光RPA对1×101 CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率为78％,对1×102 ～1×107 CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率均为100％.(3)PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠菌的总时间分别为133、93、35 min.(4)实时荧光RPA对31份疑似感染白色念珠菌临床样本的阳性检出率为32.26％(10/31),低于PCR的35.48％(11/31).11份临床样本经实时荧光RPA与PCR检测均出现阳性结果,阴性对照菌均未出现阳性结果.采用酵母/细菌基因组提取试剂盒、chelex-100加热煮沸法提取DNA进行实时荧光RPA,扩增曲线达到阈值所需时间分别为(438±13)、(462±12)s,二者相近(t=1.32,P＞0.05).液氮反复冻融法提取DNA进行实时荧光RPA,扩增曲线达到阈值所需时间为(584±15)s,明显长于另外2种方法(t =7.55、6.39,P＜0.01). 结论 实时荧光RPA检测白色念珠菌具有检测快速、操作简单、灵敏性高、特异性好等优点,值得临床推广应用.

目的 国标标准规定清洁级和SPF级小鼠必须排除仙台病毒(Sendai virus,SeV).为了提升效率,简化操作步骤,本研究建立了一种新型分子检测方法——实时荧光重组酶等温扩增技术(real-time RPA)用于检测SeV.方法 针对SeV融合蛋白编码基因的保守序列,设计特异性扩增引物及探针并建立检测方法,并评价该检测方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性.最后将该检测方法和团标PCR方法进行优势比较.结果 该方法具有很好的特异性,与小鼠肝炎病毒等六种病原微生物无交叉反应.其敏感性、稳定性和可靠性均可,并能够在25 min内完成,远远快于PCR方法.结论 本研究建立的SeV实时荧光RPA是一种操作简单,高效直观且特异性好的检测方法.

目的 重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的传统检测方法 因操作繁琐等因素,不适于现场快速检测.以乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测为例,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的HBV核酸等温扩增检测方法 并设计了配套的RPA产物可视化检测装置.方法 首先设计了可用手机拍照采集图像并经肉眼可视化判读检测结果 的RPA产物检测装置;然后根据HBV基因保守序列设计RPA引物及探针,通过监测RPA反应的实时荧光曲线来比较各引物对的扩增效率来筛选最佳引物对并优化最适的反应条件,采用人工合成的HBV靶标质粒考察可视化检测的灵敏度,并通过检测人工合成的包含丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体、流感病毒、人乳头瘤病毒核酸片段的质粒来考察了方法 的特异性;通过与实时荧光扩增曲线进行对比,验证了RPA产物可视化检测装置的可行性;最终对20份经实时荧光PCR检测过的血清DNA样本进行RPA可视化检测来评价方法 对临床实际样本检测的适用性.结果 采用RPA产物可视化检测装置实现了手机拍照肉眼观察即可判定检测结果 的阴阳性信号,HBV核酸RPA扩增可视化检测方法 可在39 ℃ 30 min内实现对低至1-10拷贝HBV DNA靶标的可视化检测,并且特异性良好;对20份血清DNA样本检测的结果 与市售qPCR试剂盒的检测结果 完全一致,初步验证了方法 及装置的实用性.结论 基于建立的HBV-RPA扩增体系,结合配套设计的RPA产物可视化检测装置,有望开发出低成本血液HBV核酸现场快速可视化筛查技术平台.

重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种近年来发展起来的等温扩增技术.不仅具有检测速度快,灵敏度高,特异性好等特点,而且由于该反应可以在体温条件下等温扩增,特别适用于实验室外的现场诊断与床边诊断,具有广泛的应用前景.本文对RPA技术的发展进行了回顾与综述,对RPA技术的扩增原理、反应机制、反应体系、引物探针设计的优化,以及在此基础上发展起来的RPA产物检测方法,如侧向流试纸、絮凝分析、实时荧光、电化学、化学发光、表面增强拉曼散射等诊断技术进行了全面阐述,同时分析了当前RPA技术发展中的热点问题,为该技术的深入研究和推广应用提供参考.

目的 探讨应用重组酶聚合酶(RPA)技术对新型隐球菌快速核酸检测,建立新型隐球菌的即时检测(POCT)方法.方法 磁珠法提取新型隐球菌标准菌株ATCC32609、150株阴性质控菌株(本实验室质控菌株和临床分离菌株)DNA.在新型隐球菌DNA的5.8SrRNA编码基因区域设计6对候选引物,以ATCC32609作为建立RPA反应体系的参考菌株,凝胶法RPA基础试剂盒筛选可稳定扩增出新型隐球菌DNA片段的引物.依次稀释ATCC32609的McF2.0菌悬液,半定量法观察扩增反应阳性引物+ATCC32609的扩增反应,扩增反应阳性引物+150株阴性对照菌株验证该反应特异性.对扩增反应阳性引物设计探针,实时荧光RPA法观察ATCC32609的扩增反应,150株阴性对照菌株验证该反应特异性.取实验室保存10株新型隐球菌临床分离株和100份临床样本(包括脑脊液50份、痰15份、胸腹水15份、静脉血20份),分别用荧光法RPA和oasig实时荧光PCR法进行DNA扩增,观察是否存在扩增反应.结果 引物2、5、6的目的条带清晰,无弥散拖尾现象,引物扩增反应阳性;对ATCC32609菌悬液1∶105稀释加入引物后扩增反应阳性;引物2、5、6均属于新型隐球菌编码核糖体RNA的DNA片段,比对结果符合率为100％;引物6扩增阴性对照菌株后,凝胶电泳未见扩增条带.引物6设计探针实时荧光反应结束时可见S形阳性扩增曲线;所有阴性对照菌株扩增结果阴性;对ATCC32609菌悬液1∶105稀释后加入引物6和探针仍可见阳性扩增曲线;以引物6和相应探针对10株新型隐球菌菌株扩增后均可见S形阳性扩增曲线.荧光法RPA试剂、oasig实时荧光PCR法检测100份临床样本中扩增反应阳性的分别为40、40份.结论 RPA技术检测新型隐球菌DNA,实时荧光法RPA技术检测新型隐球菌DNA方便快捷、准确性高.

[目的]建立一种淋球菌核酸的快速检测方法,并对该方法的灵敏度 、特异性以及与荧光定量PCR方法的检测结果一致性进行初步评价.[方法]使用重组酶聚合酶扩增-侧流层析分析(RPA-LFA)技术建立淋球菌核酸快速检测方法.使用淋球菌核酸检测国家参考品对该方法的分析灵敏度与分析特异性进行评价;使用已上市的淋球菌核酸检测荧光定量PCR法试剂盒 、RPA-LFA法分别对临床采集的61份生殖道分泌物样本进行检测,对检测结果进行一致性评价.[结果]RPA-LFA法的分析灵敏度为104 cells/mL;分析特异性良好,对10株不同淋球菌菌株均可测出,对10株非淋球菌菌株均不能测出;RPA-LFA法与荧光定量PCR方法检测一致性高(Kap-pa=0.97),RPA-LFA法的阳性检出率为52.5％(32/61)与荧光定量PCR法的阳性检出率54.1％(33/61)相比较差异无显著性(P>0.05);以荧光定量PCR方法为参比,RPA-LFA方法检测灵敏度为96.97％,检测特异性为100.00％;单个样本实时荧光定量PCR方法流程时间为120±20min,明显长于RPA-LFA的(35±5)min,且两者比较差异有显著性(P<0.05).[结论]成功建立了RPA-LFA淋球菌核酸快速检测方法,该方法与荧光定量PCR法检测结果一致性高,且不需要复杂精密的温控设备,检测结果判读简单,缩短了淋球菌核酸检测的时间,降低了成本.