已知Caveolin-1 (Cav-1)是胞膜窖的重要结构蛋白,通过介导多条信号转导途径广泛参与细胞的生理和病理过程.引人关注的是,Cav-1的表达通常具有组织特异性和功能多样性,在乳腺癌、肝癌等肿瘤的发生和发展中起到重要的调节作用.近年研究表明,Cav-1参与胰腺癌细胞放射引起的DNA损伤修复过程,从而对放疗产生抵抗.但其是否对其它种类细胞的DNA损伤也存在类似作用并不清楚.本文采用RNA干扰技术建立稳定敲低Cav-1表达的张氏肝细胞系(Chang liver cell line,CHL),即CHL-CAV7细胞,旨在探讨Cav-1在CHL细胞DNA损伤修复中的作用.Western blot结果显示,与转染非靶向质粒的对照细胞(CHL-C细胞)相比,CHL-CAV7细胞Cav-1蛋白表达水平被抑制了60％.采用X射线对细胞进行辐射,并对细胞的存活能力及DNA损伤修复相关蛋白的表达水平进行检测.克隆形成实验结果显示,在8和10 Gy X射线照射下,CHL-CAV7细胞的存活能力相对CHL-C细胞明显降低.Western blot结果显示,与CHL-C细胞相比,CHL-CAV7细胞照射后γH2AX蛋白表达量增加,p-ATM、DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase,catalytic subunit,DNA-PKcs)和p53蛋白表达量减少.免疫荧光分析结果显示,CHL-CAV7细胞Mdm2和Cav-1的共定位相对CHL-C细胞显著减少.上述结果提示,Cav-1表达下降后,CHL细胞DNA的损伤加重,这可能与Cav-1与Mdm2相互作用减少,进而导致p53的降解增加有关.本文为了解肝细胞的放疗抵抗作用机制提供了一定的实验依据.

目的 检测腺苷酸激酶4(adenylate kinase 4,AK4)在张氏肝细胞中的表达及其对张氏肝细胞增殖的影响.方法 用慢病毒介导的RNA干扰法干扰AK4在张氏肝细胞中的表达,Western blot法检测干扰AK4表达后对AKI和AK2表达的影响;细胞计数法检测干扰AK4表达后对细胞增殖速度的影响;流式细胞术检测干扰AK4表达后对细胞周期的影响.结果 AK4在张氏肝细胞中高表达,使用慢病毒干扰AK4表达后,AK1表达下降,AK2表达明显上升;细胞增殖速度明显降低;细胞周期阻滞在S期,G2期细胞明显减少.结论 AK4能够促进张氏肝细胞由S期进入G2期,从而影响细胞增殖.

目的:观察mi R-150对药物代谢酶CYP3A4的调控作用.方法:用不同浓度游离长链脂肪酸(FFA)刺激张氏肝细胞,使之成为脂肪变性肝细胞.通过荧光定量PCR和Western blot测定CYP3A4 m RNA和蛋白表达以及mi R-150表达.生物信息学分析并构建野生型CYP3A4 3'-UTR双荧光素酶报告载体,与mi R-150模拟物共转染.另外,在张氏肝细胞和脂肪变性肝细胞中分别转染mi R-150模拟物和抑制剂,检测CYP3A4 m RNA和蛋白表达.结果:张氏肝细胞经1 mmol/L FFA诱导24 h后,与对照组相比,脂肪变性肝细胞中CYP3A4 m RNA和蛋白表达均显著下降(P＜0.05),mi R-150表达上升(P＜0.05).经生物信息学分析发现CYP3A4为mi R-150的靶基因,转染质粒和mi R-150模拟物后,荧光活性下降.mi R-150模拟物可使CYP3A4 m RNA表达呈浓度梯度下降(P＜0.05),也可使CYP3A4蛋白表达下降;mi R-150抑制剂使CYP3A4 m RNA表达上升(P＜0.05).结论:mi R-150可直接与CYP3A4的3'-UTR结合,进而直接调控CYP3A4的表达.

目的 检测并比较microRNA(miRNA)-224在SMMC-7721细胞(肝癌细胞)与正常细胞(张氏肝细胞)中的表达情况.并设计反义寡核苷酸(针对miRNA-224、AMO-miR-224),以明确AMO-miR-224对SMMC-7721细胞功能及活性的影响,并探究其具体机制.方法 培养SMMC-7721细胞与张氏肝细胞;检测SMMC-7721发生凋亡的情况;荧光定量PCR (qPCR)检测细胞中miRNA-224的水平变化.结果 SMMC-7721细胞内miRNA-224的表达水平是张氏肝细胞的9.54倍;采用水平为0.3μmol/L的AMO-miR-224作用48 h,有明显的抑制效果,适合下一步的实验;同样的条件下,AMO-miR-224能够促进细胞的凋亡,且qPCR检测AMO-miR-224作用细胞后,AMO组与随机对照组相比,目的基因miRNA224水平表达下调.结论 miRNA-224在SMMC-7721中表达水平较高,AMO-miR-224可对SMMC-7721的生长起到明显抑制作用,并且可以检测到凋亡的发生,可降低SMMC 7721中miRNA224的表达水平.

目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对体外乙醇处理诱导的张氏肝细胞损伤的保护作用.方法:体外培养张氏肝细胞,实验分为对照组、乙醇处理组和NAC高、中、低剂量进行预处理的保护组,并测定NAC预处理对乙醇诱导的肝细胞损伤模型的细胞存活率,细胞内天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、活性氧(ROS)、细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平的影响,评价NAC是否对乙醇造成的肝细胞损伤具有保护作用.结果:NAC预处理后,细胞的存活率高于乙醇处理组(P<0.05),细胞形态学观察结果显示,NAC的干预组细胞形态优于乙醇处理组;NAC预处理显著降低细胞内AST、ALT、ROS和细胞上清液中TNF-α和IL-6的含量(P<0.05).结论:NAC干预可减轻体外乙醇处理诱导的肝细胞损伤,并降低细胞内ROS和炎性因子的水平.

目的 探索苦参碱(MT)对石胆酸(LCA)诱导肝损伤细胞系的保护作用及其可能的作用机制.方法 选择人张氏肝细胞(Chang liver cell)和Huh-7细胞,分别采用含双抗的1640培养基和DMEM培养基培养.将细胞分成空白组、LCA组和不同剂量MT(0.5、1和2μmol·L-1)组,分别给药后,全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBiL)和碱性磷酸酶(ALP),RT-PCR法检测孕烷X受体(PXR)和CYP3A4mRNA表达,Western blot法检测PXR和CYP3A4蛋白的表达.结果 对于人张氏肝细胞,MT可以显著降低LCA干预后细胞ALT、AST、TBiL和ALP水平;上调细胞的PXR mRNA表达,而下调CYP3A4 mRNA表达;下调细胞PXR和CYP3 A4蛋白的表达.对于Huh-7细胞,MT可显著降低LCA干预后细胞的ALT、AST和ALP水平;上调PXR和CYP3A4mRNA表达;下调CYP3A4蛋白的表达,而对PXR蛋白表达无明显影响.结论 MT可改善LCA诱导肝损伤细胞的肝功能指标,其机制可能与调控PXR-CYP3A4通路mRNA和蛋白表达有关,其对Chang live细胞和Huh-7细胞的影响不尽相同.

雷公藤甲素是传统中草药雷公藤的主要活性成分,具有多种药理作用,但其严重的不良反应(尤其是肝毒性)限制了雷公藤甲素的临床应用.本研究为探讨Notch1信号转导对雷公藤甲素诱导肝毒性的潜在保护作用.本研究以张氏肝细胞为体外模型,研究Notch1信号转导在雷公藤甲素诱导肝毒性中的作用.结果 发现雷公藤甲素引起张氏肝细胞的氧化应激和细胞凋亡,并伴随着Notch1激活信号的抑制.此外,Jagged1激活Notch1可以防止雷公藤甲素诱导的细胞毒性,而DAPH对Notch1的抑制则使损伤加重.这些结果表明,Notch1信号转导通路通过降低氧化应激和下调凋亡来改善雷公藤甲素的有害效应,Notch1的激活可能提供一种新的治疗策略来保护雷公藤甲素诱导的肝毒性.