为了探究管氏肿腿蜂Scleroderma guani寄生和注射其毒液对寄主黄粉虫Tenebrio molitor蛹中过氧化氢酶表达的影响,采用RT-PCR克隆黄粉虫过氧化氢酶基因,利用生物信息学软件分析基因序列结构特性,采用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达特征,使用试剂盒测定过氧化氢酶活性.克隆获得的黄粉虫过氧化氢酶基因编码阅读框序列长1 620 bp,编码539个氨基酸.该基因编码的氨基酸序列中含有催化氨基酸位点(His-71、Asn-183和Tyr-393)以及过氧化氢酶家族的3个保守基序:近端活性位点序列(FDRERIPERVVHAKGXG)、NADPH结合位点(XXHQXXXXFXD)和血红素配体结合位点(RXFXYXDXH).被管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液后,黄粉虫蛹中的过氧化氢酶基因的表达量显著上调,其血淋巴和脂肪体中的过氧化氢酶活性显著升高.研究结果表明,管氏肿腿蜂毒液能调控黄粉虫过氧化氢酶基因的表达.

[目的]基于自然微栖境中两种寄生性天敌球孢白僵菌Beauveria bassiana-管氏肿腿蜂Sclerodermus guani之间存在竞争和寄生的复杂关系,探究球孢白僵菌胁迫下寄生蜂的适应性生殖策略,并综合评价寄生蜂亲代携带球孢白僵菌(简称"携菌")后对自身及其子代的致死和寄生效应.[方法]采用浸虫法用不同浓度(1 ×104,1 ×105和1 ×106孢子/mL)球孢白僵菌孢悬液(简称"菌液")处理亲代(F48代)管氏肿腿蜂雌成蜂后接入装有寄主松墨天牛Monochamus alternatus幼虫的试管中,测定亲代(F48代)雌成蜂及其子代(F49代)雌成蜂的死亡率、累计死亡率和校正死亡率、产卵前期、产卵期、总产卵量及单雌产卵量;子代(F49代)和子二代(F50代)的平均发育历期、存活率、单雌体重及性比(雄性占比),结合时间-剂量-死亡率模型(time-dose-mortality model,TDM)测定球孢白僵菌对F48和F49代雌成蜂致死过程中的剂量效应和时间效应.[结果]亲代(F48代)雌成蜂携菌量随菌液浓度升高而增加,1× 104,1 × 105和1 × 106孢子/mL浓度下平均初始携菌量为0.91 ×104,1.73 ×104和1.95 ×104孢子/雌,且能将病原菌传递给下一代(F49代),1 ×104,1 × 105和1 ×106孢子/mL浓度下平均携菌量为0.78 × 104,1.40 × 104和1.51 × 104孢子/雌;该携菌现象还影响着F48和F49代雌成蜂的寿命与繁殖及其对应子代F49和 F50代的适合度.与对照(未接种球孢白僵菌)相比,不同浓度球孢白僵菌孢悬液胁迫时,亲代(F48代)雌成蜂及子代(F49代)雌成蜂的表现发生了一系列显著变化,包括:平均产卵前期明显缩短(F48代缩短了 1.03,1.43和2.03 d;F49代缩短了 0.30,0.80和1.00 d),平均产卵期延长(F48代延长了 0.30,1.00和1.30 d;F49代延长了0.43,0.73和1.43 d),总产卵量增加(F48代增加了 4.80,17.16和10.33粒;F49代增加了 11.57,25.04和9.14粒),但单雌产卵量减少(F48代减少了 4.07,7.06和15.98粒;F49代减少了 5.30,9.37和20.47粒);同样,相应后代(F49和 F50代)适合度也呈同样变化趋势;因亲代(F48代)雌成蜂携带的不同浓度球孢白僵菌(1 ×104,1 ×105和1 ×106孢子/mL)传代,F49和F50代的幼虫发育进程加快,与F49代相比,F50代的代时分别缩短了 3.00,3.00和4.00 d;同时F50代的存活率及羽化率分别降低了 16.21％和19.40％,但单雌体重分别增加了 0.09和0.94 mg,雄性后代比例分别下降了1.95％和0.22％.TDM模型检测表明,亲代(F48代)雌成蜂在接种高浓度(1 × 106孢子/mL)菌液20 d时死亡率达到50.83％,其相应子代蜂(F49代)在羽化后第18天死亡率达到50.00％,此时球孢白僵菌对F48代雌成蜂的LT50值为22.72 d,对F49代雌成蜂的LT50值为24.52 d;而同期1 × 104和1 ×105孢子/mL浓度处理下,F48和F49代雌成蜂死亡率均低于40.00％.[结论]管氏肿腿蜂亲代雌成蜂携菌后不仅降低了自身繁殖力还会间接影响其子代的存活和发育;亲代雌成蜂的携菌浓度直接影响着自身及其子代雌成蜂的累计死亡率,且随菌液浓度升高、时间延长而增加;球孢白僵菌对管氏肿腿蜂雌成蜂致死过程中的剂量效应和时间效应存在显著的互作关系.

为研究管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液过敏原3基因SgA3的功能,通过RT-PCR克隆SgA3基因,采用荧光定量PCR分析其在不同发育阶段和组织中的表达特征,并利用载体pSUMO-Mut对其进行原核表达.克隆获得SgA3基因开放阅读框长699 bp,编码233个氨基酸,其中信号肽位于N端第1～23位氨基酸.多序列比对分析发现,SgA3与丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis、粉蝶盘绒茧蜂Cotesia glomerata、红火蚁Solenopsis invicta和常见黄胡蜂Vespula vulgaris过敏原3的氨基酸序列一致性分别为50.44％、50％、48.89％和47.83％.荧光定量PCR结果表明,SgA3基因在雌成虫中高表达,且在毒液器官中的表达量显著高于雌成虫其他组织和雄成虫中的表达量.利用pSUMO-Mut表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的SgA3重组蛋白.该研究结果为进一步研究SgA3基因的功能奠定了基础.

[目的]半社会性体外寄生蜂管氏肿腿蜂Sclerodermus guani Xiao et Wu喜寄生于一些隐匿独栖(树干或木材)的钻蛀性昆虫,雌、雄个体高效地搜索配偶及交配策略是其种群定殖和扩散的关键.本研究记录了管氏肿腿蜂成虫交配行为的过程,分析、总结了其交配行为的特点.[方法]联合使用体视解剖镜、摄像机和昆虫行为跟踪仪3种仪器,在室内环境条件下系统观察了管氏肿腿蜂(雌雄比为1∶1)的交配行为,对比分析雌雄蜂在整个交配过程中的行为表现、时间分配和速度变化等特点.[结果]管氏肿腿蜂的交配过程可分为交配前、交配中和交配后3个阶段,包括触角拍击、骑上雌蜂、游走、探测和交配一系列步骤.交配前,雄蜂在培养皿内快速游走,用触角接触和拍击雌蜂,用口器接触雌蜂;骑上雌蜂后,雄蜂在雌蜂体表游走,并仍以触角拍击和口器接触雌蜂,而雌蜂则头朝下保持静止状态;雌雄蜂交配前约历时653.617±54.160 s(平均值±阳).交配中,雄蜂的生殖器与雌蜂结合进行交配,雄蜂前足基部呈45.搭在雌蜂腹部前端,中足和后足抱住雌蜂腹部末端,交配平均历时43.567±7.120 s.交配后,雄蜂离开示意交配结束,雌蜂仍保持静息状态(长达约172 s).此外,雌雄蜂均行多次交配,且随交配次数增加,交配历时先增加后逐渐减少.雌、雄蜂交配行为表现为先减速后加速,在交配前、交配中和交配后雌、雄蜂行为活动的平均速度分别为3.111,0.595和1.016 cm/s及2.754,0.895和1.314 cm/s.[结论]管氏肿腿蜂雄蜂在交配过程中较活跃,暗示其在配偶搜索、识别和选择中处于主导地位.研究结果可为该蜂室内扩繁、野外释放及复壮等生物防治技术提供理论依据.

本文以肿腿蜂科管氏肿腿蜂Scleroderma guani为研究对象,研究该蜂寄生及毒液对寄主黄粉甲Tenebriomolitor蛹营养代谢的影响.通过Br~ord法、香兰素-浓硫酸法、蒽酮法和3'5-二硝基水杨酸法分别测定管氏肿腿蜂寄生及注射其毒液对黄粉甲蛹血淋巴和脂肪体中蛋白质、脂类和糖类含量的影响.研究发现管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液能引起黄粉甲蛹血淋巴中的蛋白质含量增加和脂类含量下降,而脂肪体中的蛋白质含量减少和脂类含量升高.同时,该蜂寄生和注射其毒液,均能引起黄粉甲蛹血淋巴和脂肪体中的总糖、海藻糖和还原糖含量升高,但糖原含量下降.研究结果表明,管氏肿腿蜂毒液能调控寄主黄粉甲蛹血淋巴和脂肪体中营养物质的代谢,为揭示该蜂对寄主的营养代谢调控机制奠定了基础.

硬皮肿腿蜂Sclerodermus spp.(Hymenoptera:Bethylidae)寄生低龄天牛幼虫和吉丁类蛀干害虫.本研究利用核糖体ITS序列和3个线粒体基因序列区分8种常见的肿腿蜂.测出8种肿腿蜂的核糖体间隔区ITS1-5.8S-ⅡS2序列全长2060 bp.通过对ITS序列分析,根据ITS1序列1 319-1 333 bp位置处“CTTCT”的个数,将管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂、白蜡吉丁肿腿蜂、沙蒿吉丁肿腿蜂、苹小吉丁肿腿蜂、松脊吉丁肿腿蜂、落叶松吉丁肿腿蜂,这7种肿腿蜂分成两类,其中,管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂、白蜡吉丁肿腿蜂、沙蒿吉丁肿腿蜂为一类,有3个“CTTCT”单元,新发现的苹小吉丁肿腿蜂、松脊吉丁肿腿蜂、落叶松吉丁肿腿蜂为另一类有两个“CTrCT”单元,所以,ITS序列能够将苹小吉丁肿腿蜂、松脊吉丁肿腿蜂和落叶松吉丁肿腿蜂从已知种管氏肿腿蜂、川硬皮肿腿蜂和白蜡吉丁肿腿蜂中区分出来,也为这些新发现的肿腿蜂个体成为新物种提供理论依据;同时分析了8种肿腿蜂线粒体基因cytb,12S和16S 3个基因片段,并结合线粒体基因序列数据和系统发育树.所得的结果表明落叶松吉丁肿腿蜂的所有个体聚在一起形成一个单独的姐妹群,并且在所测的3个基因中落叶松吉丁肿腿蜂都有很高的自检支持率(90％以上).cytb和12S基因也提供了有力的证明:松脊吉丁肿腿蜂的所有个体聚集为一个单独的类群(自检支持率在90％以上).这种多个基因综合比较分析的方法,为肿腿蜂科硬皮肿腿蜂属的个体种类鉴定及线粒体基因的进化提供一定的理论依据,但最终肿腿蜂新种的鉴定仍需对其进行形态学鉴定.

为了解精氨酸激酶作为寄生蜂毒液蛋白的功能,本研究克隆了管氏肿腿蜂毒液精氨酸激酶基因的开放阅读框,分析其表达特征,并测定了该毒液蛋白在毒液中的酶活性.克隆获得的毒液精氨酸激酶基因的开放阅读框长1068 bp,编码了355个氨基酸,其理论分子量为39.71 kDa,等电点为5.86,并具有精氨酸激酶典型的N端和C端结构域,以及精氨酸和ADP结合位点、ATP-胍基磷酸转移酶活性位点和高度保守的天冬氨酸和精氨酸残基.系统进化分析表明,膜翅目精氨酸激酶分为两个亚家族,管氏肿腿蜂精氨酸激酶属于亚家族1.荧光定量PCR分析结果显示,该毒液蛋白基因在卵、 幼虫、 蛹、 雌成虫中的表达量逐渐上升,至羽化10 d时达最高.在不同组织中,该基因在头部和毒液器官中的表达量较高.通过酶活测定发现,管氏肿腿蜂毒液中精氨酸激酶的酶活性为5.18 U/g蛋白.该研究有助于今后揭示寄生蜂毒液精氨酸激酶的功能与作用机制.

[目的]本研究旨在通过克隆表达管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液丝氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologue,SPH)基因SgSPH,探索其编码的毒液蛋白对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响.[方法]利用RT-PCR技术克隆管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因的开放阅读框(ORF),采用生物信息学软件分析其基因序列结构特征;采用qPCR技术检测该基因在不同发育阶段(卵、低龄幼虫、高龄幼虫、老熟幼虫、吐丝幼虫、黄茧蛹、黑茧蛹和羽化后1-5 d成虫)和雌成虫不同组织(头部、胸部、去除毒液器官的腹部和毒液器官)中的相对表达量;利用载体pSUMO-Mut对该基因进行原核表达,用镍亲和层析柱纯化表达的重组蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot对获得的重组蛋白进行鉴定;用酶活性测定方法,分析SgSPH重组蛋白对寄主黄粉虫Tenebrio molitor蛹血淋巴酚氧化酶活性的抑制作用.[结果]克隆获得管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因(GenBank登录号:MT920663)的ORF,长798 bp,编码265个氨基酸,其中第1-20位氨基酸为信号肽,理论分子量为30.53 kD,等电点为9.59.多序列比对分析表明,SgSPH与其他寄生蜂毒液丝氨酸蛋白酶和SPH具有较低的氨基酸序列一致性(9％～17％),且缺乏保守的催化三联体.qPCR分析表明,SgSPH基因在管氏肿腿蜂成虫阶段和毒液器官中高表达.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测发现,成功表达SgSPH重组蛋白,并纯化得到了高纯度SgSPH重组蛋白.酶活性检测结果显示,SgSPH能抑制寄主黄粉虫蛹血淋巴的酚氧化酶活性.[结论]结果提示管氏肿腿蜂毒液SgSPH具有干扰寄主酚氧化酶级联反应的功能.

[目的]克隆和表达管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液抗凝血酶Ⅲ(AntithrombinⅢ)基因SgAT-Ⅲ,为深入研究该毒液基因的生理功能奠定基础.[方法]利用逆转录PCR技术克隆SgAT-Ⅲ基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列,使用生物信息学软件分析其基因序列结构特征,通过qPCR技术分析其在雌成虫不同组织中的表达模式,采用载体pCzn1对其进行原核表达.[结果]克隆得到SgAT-Ⅲ基因的ORF,长1338 bp,编码446个氨基酸,其中第1-19位氨基端为信号肽,理论分子量49.49 ku,等电点6.23.多序列比对分析表明,SgAT-Ⅲ与蚂蚁AT-Ⅲ具有较高的氨基酸一致性(＞64％),C末端具有serpin蛋白家族典型反应中心环区,含有供靶标蛋白识别的活性裂解位点.系统发育分析表明,SgAT-Ⅲ与膜翅目其他昆虫的AT-Ⅲ亲缘关系较近,且与蚂蚁的AT-Ⅲ聚为一支.qPCR分析表明,SgAT-Ⅲ基因在毒液器官中高表达.SDS-PAGE电泳检测发现,成功表达SgAT-Ⅲ重组蛋白,纯化得到高纯度的重组蛋白.[结论]克隆得到SgAT-Ⅲ基因,其在毒液器官中高表达,纯化得到SgAT-Ⅲ重组蛋白,为进一步研究该毒液基因的生理功能奠定了基础.

[目的]硬皮肿腿蜂Sclerodermus母蜂可合作寄生寄主,但在产卵前需不断蛰刺释放毒液以麻醉寄主.已明确合作可有效制服和寄生体型较大的寄主,但迄今对由此而付出的适合度代价尚不明确.[方法]用管氏肿腿蜂S.guani和替代寄主黄粉虫Tenebrio molitor蛹为材料,在两头已交配雌蜂(母蜂)分别合作0.5,1.5和2.5 d后保留其中一头(称"受益蜂")继续后续寄生过程,将另一头雌蜂("利他蜂")移至一头新寄主上完成寄生过程,观测比较两类雌蜂的存活、产卵量和子代蜂群发育表现.[结果]无论合作时间长短,管氏肿腿蜂利他蜂的死亡风险(瞬时死亡概率)比受益蜂高5.4倍.合作0.5 d的利他蜂与受益蜂的产卵前期没有显著差异,但合作1.5 d的利他蜂产卵前期比受益蜂的缩短14.1％,合作2.5 d的利他蜂产卵前期比受益蜂的缩短28.6％.利他蜂与受益蜂在产卵量、子代出蜂数及子代蜂性比(雄性比)上没有差异.无论合作时间长短,利他蜂的子代卵历期比受益蜂的长6.8％,利他蜂的子代幼虫历期比受益蜂的长8.4％.利他蜂与受益蜂的子代雌成虫体重在合作0.5 d和1.5 d下没有差异,但在合作2.5 d下的利他蜂子代雌蜂体重比受益蜂的减小25.4％.[结论]本研究明确了管氏肿腿蜂母蜂在产卵前的合作尤其是较长时间合作需付出生存和某些子代发育特征的适合度相关代价.