核酸适配体以其类似抗体的功能及诸多优于抗体的特点引起人们的广泛关注,如何利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX技术)来高效地筛选核酸适配体是其应用的关键.结合近些年核酸适配体的研究进展,为提高筛选效率及核酸适配体性能,针对适配体筛选三大不同环节所做的尝试及改良进行相关的阐述,包括初始随机寡核苷酸文库的设计与修饰、筛选过程所用方法及次级文库的制备、筛选过程后(Post-SELEX)核酸适配体性能的优化等;特别比较了筛选方法包括毛细管电泳SELEX、细胞SELEX、磁珠SELEX、加尾SELEX、微流控SELEX、微阵列SELEX和高通量SELEX,以及次级文库的制备方法诸如不对称PCR法、λ核酸外切酶法、磁珠法、不等长PCR法、综合性方法等;对核酸适配体发展面临的问题及发展前景进行探讨,以期为相关科研人员的研究提供参考.

目的 筛选与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)表面脂多糖( LPS)特异性结合的适配体,探讨其抑制巨噬细胞极化的效果.方法 提取PA的LPS成分,通过指数富集的配基系统进化技术 ( SELEX)筛选与其特异性结合的高亲和力 DNA 适配体,利用酶联寡聚核苷酸吸附试验(ELONA)、定量PCR(Q-PCR)等方法探讨其对巨噬细胞极化的影响.结果 本研究筛选出能与PA-LPS特异性结合的适配体PL-6,并发现其能够阻断PA-LPS与相应受体TLR4的结合,抑制巨噬细胞M1型过度极化,维持巨噬细胞稳态.结论 本研究筛选出可与PA-LPS特异性结合的高亲和力适配体,为PA可能引起脓毒症的预防和治疗提供了新的策略.

新的肿瘤标志物的鉴别对推进研究肿瘤发生发展机制以及早期诊断具有极其重要的意义.而基于Cell-SELEX(细胞指数富集配体系统进化)方法得到的核酸适体具有特异性区分肿瘤细胞、非肿瘤细胞以及肿瘤干细胞、不同分化程度的肿瘤细胞的特性.本篇概述了近年来基于Cell-SELEX技术筛选得到的核酸适体进行肿瘤标志物鉴别的系统方法,探讨了Cell-SELEX技术用于鉴别潜在肿瘤标志物的可行性,回顾了近年来基于该方法鉴别肿瘤标志物的发展进程,并总结了目前此方法面临的困难与挑战及可能的改善方法.

目的:筛选能特异识别vasorin (VASN)蛋白的单链DNA(ssDNA)适配体并对其进行鉴定.方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ssDNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序列,利用EMSA、ELISA、流式细胞术对候选适配体进行特异性与亲和力鉴定.结果:经过5轮SELEX筛选,获得了与VASN蛋白特异结合的ssDNA适配体富集文库,合成候选适配体,经EMSA和ELISA检测分析,证实适配体V4-2能与VASN蛋白特异结合,而不与无关对照牛血清白蛋白结合,其平衡解离常数为281.3±103.7 nmol/L;流式细胞术证实V4-2能够特异识别高表达VASN蛋白的HepG2细胞.结论:筛选获得特异识别VASN蛋白的ssDNA适配体V4-2.

目的:采用指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选获得一组已知和未知肝癌血清肿瘤标志物的适配体,为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法.方法:收集50例首次经诊断证实为原发性肝癌的患者血清,以及50例体检无异常的正常人血清,并分别等比例混合制备成肝癌混合血清和正常人混合血清,作为筛选的靶标分子,磁珠作为分离载体.先将磁珠-正常人血清复合物与ssDNA文库结合,取上清再与磁珠-肝癌血清结合,经过洗脱、分离与肝癌血清结合的特异性ssDNA,并进行扩增,链霉亲和素磁珠法制备次级ssDNA,进行9轮筛选,将9轮筛选获得的饱和文库与PMD 18-T载体连接进行转化、挑选单克隆送上海生工进行测序,同时利用流式细胞术测定肝癌血清肿瘤标志物适配体的亲和力(Kd值).结果:经9轮筛选,成功分离出200个核酸序列,其中序列不同的有10个.特异性检测表明,筛选得到的肝癌血清肿瘤标志物适配体与肝癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中Seq-1、Seq-16、Seq-17、Seq-56、Seq-72号适配体能高特异性结合肝癌血清,与正常人血清不结合,再通过200例肝癌血清和200例正常人血清进一步鉴定5条肝癌血清肿瘤标志物适配体检出肝癌的阳性率,阳性检出率达91％以上.结论:利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与肝癌患者血清特异性结合的适配体,所获得的适配体具有拮抗肝癌血清的能力,有可能为肝癌的早期诊断提供新的便捷方法.

目的:筛选获得特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC1)的单链DNA适配体.方法:合成全长81 nt,中间含39个随机序列的单链寡核苷酸(ssDNA)文库,运用指数富集配基系统进化(SELEX)技术筛选获得GPC1适配体;酶联免疫吸附分析法(ELISA)实验确定候选适配体与GPC1蛋白的亲和力,流式细胞术确定候选适配体与2种GPC1高表达细胞系(胰腺癌Panc-1细胞和工具细胞Luc-ZR-75-1GPC1)的结合特异性.结果:经过10轮SELEX筛选获得坍适配体,ELISA分析其亲和力为44±0.69 nmol/L,流式细胞术结果表明其与胰腺癌Panc-1细胞和Luc-ZR-75-1GPC1细胞的阳性结合率分别为44.69％和51.44％.结论:筛选获得与GPC1蛋白有较高亲和力、与表达GPC1细胞系特异结合的ssDNA适配体.

Cell-SELEX技术是在指数富集的配体系统进化(SELEX)技术的基础上,获取能与特定靶细胞结合的适配体的方法.将Cell-SELEX技术获得的适配体与各类药物分子或分子纳米材料等相结合构成复合物,可构建不同的靶向药物递送系统.这类药物递送系统利用适配体的靶向性,将药物分子等特异地递送到相应的靶细胞,从而达到诊断、治疗疾病、提高药物浓度或者降低毒副作用等目的.本文简要介绍了Cell-SELEX技术的发展现状及目前主要的靶向药物递送系统的应用.

目的 以人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721作为混合靶标筛选获得特异性核酸适配体并对其进行鉴定.方法 以HepG2和SMMC-7721两种人源肝癌细胞为筛选混合靶标,利用细胞指数富集的配基系统进化(Cell-SELEX)技术筛选获得核酸适配体.利用流式细胞术检测文库富集情况,将富集文库进行克隆、测序,应用RNA structure、MEME在线软件进行序列分析,再次通过流式细胞术鉴定核酸适配体与靶标的结合能力及特异性.结果 通过10轮Cell-SELEX筛选得到核酸适配体10-8,流式细胞术检测显示核酸适配体10-8与人源肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721细胞结合,且特异性靶向肝癌细胞.结论 筛选获得与人源肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721双靶标特异性结合的核酸适配体10-8.

目的 探讨利用细胞指数富集配基的系统进化(SELEX)技术筛选特异性靶向并结合上皮细胞黏附分子(EpCAM)阳性前列腺癌(PCa)细胞的适配体的方法.方法 设计随机 DNA 文库,以表达 EpCAM分子的人 PCa 细胞为靶标,利用细胞 SELEX技术筛选 EpCAM特异性DNA适配体.经过 1 2 轮体外筛选,对 DNA产物进行克隆和测序,用流式细胞术、细胞免疫荧光技术检测适配体对靶细胞特异性结合的能力.结果 从随机单链DNA文库中筛选出的2 条EpCAM适配体Ep1 和Ep2 均能特异性结合人PCa细胞 LNCaP、PCG3 、DU145 和慢病毒表达载体 pCDHGEpCAM转染的 HEK2 9 3T 细胞,而不能结合空载体 pCDH 转染的HEK293T细胞,且Ep1 对各细胞的结合率分别为61.0%、74.3%、59.1%、60.3%、5.4%,Ep2对各细胞的结合率分别为65.1%、77.8%、54.2%、5 8.3%、3.3%.结论 经细胞SELEX技术筛选的EpCAM适配体能特异性识别并靶向EpCAM阳性的PCa细胞,有望为PCa的特异性诊断和靶向性治疗提供新思路,同时也为其他恶性肿瘤特异性诊疗方案的研究奠定实验基础.

核酸适配体(aptamer)是在体外采用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)从人工合成的随机寡核苷酸文库中筛选得到的一段寡核苷酸序列(RNA或DNA),能折叠成特定的三维空间结构同靶物质进行高特异性与高亲和性的结合.近年来,以全细胞为靶标筛选(cell-SELEX)获得的核酸适配体在疾病相关的领域有很大的应用潜力,尤其在细胞分子的识别、生物标志物的发现等方面,但cell-SELEX的过程复杂、难度大及获得的核酸适配体性能不佳等问题仍然制约着细胞特异性核酸适配体的进一步发展,如何高效地筛选获得核酸适配体是其应用的关键.本文总结了目前在cell-SELEX技术基础上发展起来的新方法、新策略及核酸适配体在肿瘤研究中的应用,望为相关科研人员的研究提供参考.