目的 探究肝豆扶木汤对 Erastin 诱导的肝癌细胞 HepG2 铁死亡的影响,以及对溶质载体家族 7 成员 11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化酶 4(GPX4)轴的调控作用.方法 利用BATMAN-TCM数据库获取肝豆扶木汤的活性成分及潜在靶点,GeneCards数据库检索铁死亡相关靶点,将所得的肝豆扶木汤活性成分的潜在靶点与铁死亡相关靶点进行交集筛选后,再借助CB-Docking软件进行分子对接,最后对结合度较好的靶点进行细胞实验初步验证.体外细胞实验构建Erastin诱导的HepG2 细胞铁死亡模型,设置空白组、模型组和肝豆扶木汤低、中、高剂量组,检测细胞还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平,RT-qPCR 和 Western blot 法验证细胞 P53、SLC7A11、GPX4 mRNA和蛋白表达.结果 肝豆扶木汤中有效成分共 215 种,潜在靶点 1 741 个,铁死亡相关靶点275 个,其中Relevance score≥3 的共23 个.取交集后,肝豆扶木汤中活性成分为19 种,铁死亡相关靶点为11 种.肝豆扶木汤关键有效成分与靶点SLC7A11、P53、VDAC2/3、ACSL4、HMOX1、ALOX15、PRKAA1 等均有一定的结合活性,其中与 SLC7A11 蛋白靶点结合能力最强.肝豆扶木汤能提高细胞 GSH、ROS、MDA 水平(P<0.01),上调SLC7A11、GPX4 mRNA和蛋白表达(P<0.01),下调P53 mRNA和蛋白表达(P<0.01).结论 肝豆扶木汤可能是通过调控SLC7A11/GPX4 轴来抑制Erastin诱导肝癌细胞HepG2 铁死亡的发生,从而起到保护肝细胞的作用.

综述肝豆状核变性(HLD)肝纤维化的主要发病机制、发病特征、诊断技术及中西医研究进展.HLD肝纤维化以"铜毒内蕴,肝失疏泄"为病因病机,呈现出"以虚为主,因虚致实,虚实并见"的病机演变特点,治疗上当以"疏肝利胆、通腑利尿"为先,倡导分型论治该病证,形成了肝豆汤、肝豆灵片、肝豆扶木汤、清热利胆解毒方、补肾化痰祛瘀方等行之有效的中医方药.研究表明,中医药疗法可有效逆转 HLD肝纤维化和部分肝硬化进程,在改善病人临床预后方面具有重要意义.

目的:观察肝豆扶木汤对 Wilson 病步态障碍痰瘀互结证的临床疗效.方法:将入组的 80 例Wilson病步态障碍痰瘀互结证患者采用随机数字表法分为对照组和治疗组,每组40 例.对照组在常规低铜饮食和保肝治疗的基础上予以二巯丙磺酸钠注射液排铜治疗;治疗组在对照组治疗方法的基础上联合肝豆扶木汤治疗.以8d为1 个疗程,共治疗3 个疗程,比较两组治疗前、2 个疗程末及3 个疗程末的改良Young量表评分、步态障碍测试结果[包括"起立—行走"时间(TUG)和Tinetti量表评分]、24 h尿铜含量.结果:治疗后对照组和治疗组的改良Young量表评分、"起立—行走"时间均低于治疗前,且治疗组的降低幅度大于对照组(P<0.05,P<0.01);Tinetti量表评分、24 h尿铜含量均较治疗前上升,且治疗组的上升幅度大于对照组(P<0.05,P<0.01).结论:肝豆扶木汤可以增加Wilson病步态障碍痰瘀互结证患者的铜排泄量,有效改善其步态障碍症状,减少起步时间,提高步行能力,从而延缓病程,提升独立生活水平,值得在临床中推广使用.

目的 观察肝豆扶木汤(GDFMT)对 TX小鼠肝纤维化转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制.方法 将24只雄性 TX小鼠随机分为模型组、青霉胺组、GDFMT组,另设正常对照组.采用竞争性放免分析法检测血清肝纤维化透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)含量,免疫组化法观察肝组织 TGF-β1、Smad2和 Smad7蛋白的表达.结果 血清肝纤维化指标结果:与正常对照组比较,模型组血清肝纤维化 HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均明显升高(P<0.01);与模型组比较,青霉胺组和 GDFMT组血清肝纤维化 HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P<0.05或P<0.01);与青霉胺组比较,GDFMT组血清肝纤维化 HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ含量均降低(P<0.05).免疫组化法观察结果:与正常对照组比较,模型组 TGF-β1和 Smad2蛋白表达明显升高,Smad7蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,青霉胺组和 GDFMT组 TGF-β1和 Smad2蛋白表达明显降低(P<0.05),Smad7蛋白表达明显升高(P<0.01);与青霉胺组比较,GDFMT组 TGF-β1和 Smad2蛋白表达明显降低(P<0.05),Smad7蛋白表达明显升高(P<0.05).结论 GDFMT可以能降低 TX小鼠肝纤维化血清学指标,具有良好的抗肝纤维化的作用,其作用机制可能是抑制 TGF-β1和 Smad2蛋白的表达,上调 Smad7蛋白的表达.

目的 探讨肝豆扶木汤(Gandou Fumu Decoction,GDFMD)对Wilson病肝纤维化模型TX(toxic milk)小鼠TGF-β1/Sm ad信号通路表达的影响.方法 60只TX小鼠随机分为模型组、GDFMD高、中、低剂量组和青霉胺组,每组12只,另设正常组12只.GDFMD高、中、低剂量组按31.2、15.6、7.8g生药/kg进行灌胃,青霉胺组按0.1 g/kg(0.2 mL/10 g)灌胃,模型组和正常组给予等容积生理盐水,每天1次,连续灌胃4周.采用赖氏法检测血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活力,溴甲酚绿法检测血清白蛋白(album in,ALB)含量;采用HE染色、Masson染色观察肝组织病理变化;采用RT-PCR和Western blot检测肝组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA和蛋白的表达.结果 (1)与正常组比较,模型组血清ALT、AST活力升高,ALB含量降低(P＜0.01),与模型组比较,GDFMD高、中剂量组和青霉胺组ALT、AST活力降低,ALB含量升高(P＜0.01),GDFMD低剂量组AST活力降低,ALB含量升高(P＜0.05).(2)模型组可见肝纤维化特征性病理表现,备用药组均有不同程度改善.(3)与正常组比较,模型组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA和蛋白表达升高,Smad7 mRNA和蛋白表达降低(P＜0.01),与模型组比较,GDFMD高、中剂量组和青霉胺组TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA和蛋白表达降低,Smad7 mRNA和蛋白表达升高(P ＜0.05,P＜0.01),GDFMD低剂量组TGF-β31 mRNA和蛋白、Smad2蛋白表达降低,Smad7蛋白升高(P ＜0.05,P＜0.01).结论 GDFMD具有抗肝纤维化作用,其作用机制可能与调控TGF-β1/Smad信号通路相关因子的基因与蛋白表达有关.

目的:观察肝豆扶木汤(GDFMT)对Wilson病肝纤维化毒乳鼠(TX)小鼠肝组织转化生长因子β受体1 (TβRⅠ)、2(TβRⅡ)及Smad4的影响.方法:40只TX小鼠随机分为模型组,GDFMT高、中、低剂量组及青霉胺组,每组8只,8只DL小鼠作为正常组.各组给予相应药物,4周末检测小鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原蛋白(PC-Ⅲ)、Ⅳ型胶原蛋白(C-Ⅳ)含量,免疫组化和RT-PCR测定肝组织TβR Ⅰ、TβRⅡ及Smad4蛋白和mRNA表达.结果:与模型组比较,GDFMT高、中、低剂量组可以显著降低TX小鼠HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ水平,改善肝纤维化病理,抑制TβRⅠ、TβRⅡ及Smad4蛋白和mRNA表达(P＜0.01,P＜0.05).结论:GDFMT可以有效地逆转TX小鼠肝纤维化,其机制可能与抑制肝组织TβRⅠ、TβRⅡ及Smad4蛋白和mRNA表达有关.

目的:基于磷脂酰肌醇3,激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路探讨肝豆扶木汤(GDFMD)对氯化铜(CuCl2)诱导的人肝癌细胞(HepG2)氧化损伤的保护作用.方法:HepG2细胞分为空白组,模型组,GDFMD组,PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235(10 nmol·L-1)组,GDFMD+NVP-BEZ235 (10 nmol·L-1)组.采用200 μ mol·L-1 CuCl2构建模型组铜负荷HepG2细胞,酶联免疫吸附测定法(ELISA)观察细胞超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量;免疫荧光观察细胞微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K,磷酸化Akt(p-Akt)/Akt,磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR,Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ,p62表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞PI3K,Akt,mTOR,Beclin-1,LC3Ⅰ,LC3Ⅱ,p62 mRNA表达.结果:与空白组比较,模型组细胞SOD,GSH-Px活性下降,MDA含量显著升高(P＜0.01);与模型组比较,10％ GDFMD含药血清组SOD,GSH-Px活性升高,MDA含量下降(P＜0.05,P＜0.01);NVP-BEZ235组GSH-Px活性下降,MDA含量升高(P＜0.05).与空白组比较,模型组p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR,p62表达水平显著降低,Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平显著升高(P＜0.01);与模型组比较,10％ GDFMD组p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR,p62表达水平升高,Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ表达水平下降(P＜0.05,P＜0.01);NVP-BEZ235组p-PI3K/PI3K,p-mTOR/mTOR表达水平下调,Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ表达水平升高(P＜0.05,P＜0.01).与10％ GDFMD组比较,10％ GDFMD+NVP-BEZ235组p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR表达水平下降,Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ表达水平升高(P＜0.05,P＜0.01).与空白组比较,模型组LC3Ⅱ蛋白表达显著升高(P.＜0.01);与模型组比较,10％ GDFMD组LC3Ⅱ蛋白表达降低,与10％ GDFMD组比较,10％ GDFMD+NVP-BEZ235组LC3Ⅱ蛋白表达升高.各组PI3K,Akt,mTOR mRNA相对表达量差异无统计学意义,与空白组比较,模型组p62 mRNA相对表达量显著降低,Beclin-1,LC3 Ⅰ,LC3ⅡmRNA相对表达量显著升高(P＜0.01);与模型组比较,10％ GDFMD组p62 mRNA相对表达量升高,Beclin-1,LC3 Ⅰ,LC3ⅡmRNA表达水平下调(P＜0.01);NVP-BEZ235组Beclin-1 mRNA相对表达量升高(P＜0.05).与10％ GDFMD组比较,10％GDFMD+NVP-BEZ235组Beclin-1,LC3ⅡmRNA相对表达量升高(P＜0.01).结论:GDFMD能抑制CuCl2诱导的HepG2细胞过度自噬,减轻细胞氧化损伤,其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关.

目的 基于网络药理学方法研究肝豆扶木汤(GDFMD)治疗肝豆状核变性肝纤维化(LF)的作用机制.方法 基于TCMSP数据库及Uniprot数据库筛选出GDFMD有效成分及靶点基因.通过GeneCards数据库及OMIM数据库筛选出LF的疾病靶点基因,并用Cytoscape软件构建"活性-成分-靶点"相互作用网络图.将有效成分靶标与疾病靶点上传到STRING数据库,构建蛋白互作网络图(PPI),使用R语言进行核心基因的筛选并对关键靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.基于网络分析结果,选择PI3K/Akt信号通路进行动物实验验证.将20只肝豆状核变性LF模型TX小鼠随机分为模型组、GDFMD组,10只相同遗传背景的野生型小鼠作为对照组.GDFMD组按6.969生药/kg进行灌胃,模型组和对照组给予等容积生理盐水,每天1次,连续灌胃4周.观察肝脏组织病理学改变.采用ELISA法检测血清肝纤四项[透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原蛋白(PC-Ⅲ)、Ⅳ型胶原蛋白(C-Ⅳ)]、羟脯氨酸(Hyp)含量,采用qRT-PCR法检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、1型胶原蛋白(Col-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)mRNA的表达,采用Western Blot法检测肝组织α-SMA、Col-1、PI3K、Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达.并通过TUNEL法检测肝细胞凋亡水平.结果 (1)预测得到GDFMD治疗肝豆状核变性LF的有效成分55个及共作有效靶点95个.有效成分中度值较高的为槲皮素(quercetin),β-谷甾醇(beta-sitosterol)及山柰酚(kaempferol),作用靶点中度值较高的为丝裂原激活蛋白激酶8(MAPK8),表皮生长因子受体(EGFR)与白介素6(IL-6).PPI网络中核心基因为MAPK8及EGFR等;GO富集分析显示会影响基因的转录、核受体活性等;KEGG通路富集分析显示磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路、凋亡信号通路、低氧诱导因子-1信号通路为显著富集的通路.(2)动物实验表明,GDFMD组能改善肝豆状核变性肝损伤尤其是肝纤维化.与模型组比较,GDFMD组血清HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、Hyp含量降低(P＜0.05,P＜0.01),α-SMA、Col-1 mRNA及蛋白表达降低(P＜0.05,P＜0.01);PI3K、Akt mRNA及蛋白表达升高(P＜0.01,P＜0.05);肝组织凋亡细胞数目降低(P＜0.05),Bax mRNA和蛋白表达降低(P＜0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达升高(P＜0.05).结论 通过网络药理学的方法预测GDFMD防治肝纤维化的关键作用靶点及相关通路,其不仅具有抗肝纤维化的作用,尚有抗凋亡、抗炎、调节脂代谢等生物学功能.

目的:研究FibroTouch(FT)技术联合血清无创肝纤维化模型(NIT)对肝豆状核变性(WD)肝纤维化的诊断价值及肝豆扶木汤对WD肝纤维化的临床疗效.方法:系统回顾性收集WD肝纤维化患者68例随机分为治疗组和对照组,每组34例.对照组予以常规西药治疗,治疗组在对照组基础上加用中药汤剂肝豆扶木汤进行治疗.统计肝硬度值(LSM)、肝脏血清学指标[透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)、谷丙转氨酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(-γ-GGT)]、血小板(PLT)及NIT模型评分,分析LSM及NIT模型的曲线下面积,计算约登指数(YI).结果:两组治疗后肝脏各项指标均较治疗前显著改善(P＜0.01,P＜0.05);治疗组治疗后LSM值、NIT模型指标、ALT、AST、PLT、HA、LN指标改善较对照组更显著(P＜0.01,P＜0.05);联合诊断的诊断价值高于单项诊断.结论:FT技术与血清NIT联合提高了WD肝纤维化的诊断准确性;肝豆扶木汤具有逆转WD肝纤维化进程作用.