目的 构建真核细胞延长因子2(eukaryotic elongation factor 2,eEF2)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,为后续研究eEF2在乳腺癌细胞发生发展中的作用提供实验依据.方法 根据eEF2的基因序列和短发夹RNA序列的设计原则设计合成3对shRNA序列,将shRNA序列复性后插入慢病毒载体LV-U6-shR-NA-ZSgreen-Puro,构建3种不同eEF2基因敲低靶点的重组质粒sh1、sh2、sh3,以空载体作为阴性对照组(shNC).采用慢病毒三质粒包装系统共分别转染人肾上皮细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增.经酶切及测序验证正确后,将重组慢病毒感染对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7,72h后荧光显微镜观察绿色荧光强度,实时荧光定量PCR(qPCR)法检测eEF2 mRNA转录水平,Western blot法检测eEF2蛋白表达水平.结果 eEF2 shRNA载体测序与原设计序列完全一致.重组慢病毒感染的MCF-7中可见绿色荧光蛋白表达.与shNC组相比,eEF2敲低的sh2和sh3组MCF-7细胞中eEF2 mRNA的转录水平明显降低(t分别为9.244和5.938,P分别为0.001和0.004);sh1、sh2和sh3组细胞中eEF2蛋白的表达水平均明显降低(t分别为3.552、9.614和4.432,P分别为0.024、0.001和0.011).结论 成功构建了eEF2基因低表达的慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,有望为临床乳腺癌的治疗提供基于翻译靶向治疗的新靶点.

目的:构建靶向HLA-A2且表达PDL1的嵌合抗原受体修饰的调节性T细胞（CAR-Treg），探讨CAR-Treg对CD4+ T细胞的抑制作用。方法:设计并合成CAR基因，通过慢病毒载体质粒构建靶向HLA-A2且表达PDL1的CAR-Treg核心质粒，通过BamHI/EcoRI双酶切鉴定，应用流式细胞仪检测转染CAR质粒后T细胞的CAR表达情况；通过抑制HLA-A2+/-乳腺癌细胞的增殖实验，证实CAR能够成功靶向HLA-A2靶点；后续通过流式细胞仪检测Foxp3、PDL1、CD25、ICOS、CTLA4等与Treg细胞功能相关的标志，并联合细胞代谢分析及体外抑制CD4+ T细胞增殖实验，验证CAR-Treg抑制CD4+ T细胞的能力。结果:双酶切鉴定结果显示，靶向HLA-A2的CAR质粒构建成功，流式细胞仪检测CAR-T/CAR-Treg细胞均证实细胞表面有HLA-A2 CAR稳定表达。HLA-A2 CAR-T细胞与MCF-7（HLA-A2+）乳腺癌细胞共同培养，证实表达HLA-A2的CAR-T细胞能够成功识别HLA-A2靶点。流式细胞检测显示CAR-Treg明显表达Foxp3和PDL1，细胞增殖数量及传代数明显增加。细胞代谢分析显示，CAR-Treg表现出比普通Treg细胞更高的基础细胞耗氧率，CAR-Treg更依赖于脂肪酸氧化代谢。细胞增殖抑制实验显示，CAR-Treg能在体外高效地抑制CD4+ T细胞增殖。结论:成功构建靶向HLA-A2且表达PDL1的CAR-Treg，能在体外高效抑制CD4+ T细胞增殖，为后续的动物体内实验提供了实验基础。

目的 探讨巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)在垂体腺瘤(PAs)中的表达及对肿瘤发生发展的作用及其机制.方法 纳入2021年11月至2022年7月在华中科技大学同济医学院附属同济医院神经外科收治的PAs患者20例.收集患者的手术标本.检测肿瘤组织及PAs细胞系(GH3、AtT20和TtT/GF)MIF分子的转录和表达水平.采用慢病毒转染构建稳定转染的MIF过表达(oeMIF)和沉默(shMIF)的细胞系.采用划痕实验、体外组织肿瘤种植模型、酶联免疫吸附试验(ELISA)实验等检测MIF表达改变对细胞迁移、促肾上腺皮质激素(ACTH)激素分泌、组织肿瘤侵袭和血管生成的影响.两组间比较采用两样本独立t检验.结果 PAs患者的MIF表达水平明显高于对照组(2.850±0.838比1.065±0.435,t=3.565,P＜0.01).MIF在PAs细胞系中表达高于对照组(GH3:1.730±0.260 比 1.001±0.091,t=5.957,P＜0.01;AtT20:1.853±0.108 比 1.008±0.147,t=8.307,P＜0.01;TtT/GF:3.087±0.21 比 1.008±0.147,t=15.430,P＜0.01).oeMIF 的PAs细胞系划痕迁移愈合率高于对照组(0.758±0.044比0.581±0.045,t=4.903,P＜0.01),而shMIF的PAs细胞系划痕迁移愈合率低于对照组(0.425±0.036比0.581±0.045,t=4.689,P＜0.01).shMIF组肿瘤血管生成的分叉点及分支数均明显少于对照组(分叉点:53.652±15.675比35.304±10.218,t=4.703,P＜0.01;分支数:35.913±6.721 比 30.609±6.854,t=2.650,P＜0.05).oeMIF 的 PAs 细胞系分泌 ACTH 水平高于对照组(1.198±0.026 比 1.000±0.077,t=4.863,P＜0.01),而shMIF的PAs细胞系分泌ACTH水平低于对照组(0.845±0.034比1.000±0.077,t=3.673,P＜0.05).结论 垂体瘤组织和细胞系MIF表达增加,MIF可能产生促进PAs发生发展及ACTH分泌的作用.

目的 探讨序列相似性家族107成员A(FAM107A)调控缺氧诱导因子3A(H1F3A)对前列腺癌(PCa)迁移、侵袭、凋亡的影响.方法 通过生物信息学技术筛选目的基因并进行分析.体外培养人PCa细胞PC-3,采用反转录病毒稳定转染,采用蛋白质印迹法(Western blot)技术验证HIF3A及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达量;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;焦磷酸测序检测启动子甲基化程度;细胞功能试验验证对PCa迁移和侵袭的影响.两组间差异表达采用独立样本t检验方法比较.结果 生信分析提示FAM107A基因在PCa组织中表达低于正常前列腺组织(P＜0.01),Gleason评分(GS)越高,FAM107A表达量越低(P＜0.01).划痕实验、Transwell侵袭实验提示过表达 FAM107A会抑制 PCa 细胞的迁移(C4-2:0.337±8.930 比 29.334±2.651,t=-7.260,P＜0.05;PC-3:18.672±10.494 比 52.043±3.512,t=-6.024,P＜0.05)、侵袭(DU145:117.703±12.845 比 242.303±21.401,t=10.273,P＜0.05;PC-3:51.674±9.502 比 139.303±13.394,t=16.025,P＜0.05),促进凋亡(17.180±0.700 比 0.527±0.121,t=40.600,P＜0.05).细胞周期实验表明oe-FAM107A-ENZ组细胞G1期比例高于对照组(80.410±0.786比35.583±0.714,t=73.130,P＜0.05),S 期比例低于对照组(11.233±0.374 比 38.747±1.809,t=25.790,P＜0.05),细胞分裂被阻滞在S期.蛋白免疫印迹实验证明过表达FAM107A组的DNMT1表达量低于对照组(0.277±0.032 比 0.900±0.026,t=25.93,P＜0.05),HIF3A 表达量高于对照组(0.657±0.040 比0.523±0.043,t=4.041,P＜0.05).sh-FAM107A-5-aza 组的 HIF3A 的表达量明显恢复(0.550±0.020比0.427±0.067,t=3.073,P＜0.05).蛋白免疫印迹实验证明过表达FAM107A时E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达量高于对照组(0.773±0.095 比 0.307±0.046,t=7.683,P＜0.05),N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达量低于对照组(0.380±0.060 比 0.733±0.045,t=8.154,P＜0.05),波形蛋白(Vimentin)表达量低于对照组(0.347±0.107 比 0.700±0.040,t=5.361,P＜0.05).结论 FAM107A高表达可抑制HIF3A启动子甲基化促进其表达,进而抑制PCa的迁移、侵袭,是PCa进展的生物标志物.

目的 研究死亡结构域相关蛋白(death domain-associated protein,DAXX)在乳腺癌细胞MCF-7中的表达及核-质定位,并探讨这两者对MCF-7细胞功能的影响.方法 通过构建LV-DAXX-RNAi-GFP干扰与LV-DAXX-GFP过表达慢病毒质粒,转染MCF-7细胞,敲低和过表达DAXX.采用核-质分离法与免疫荧光法验证DAXX在MCF-7细胞中的表达与核-质定位,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞增殖情况.结果 核-质分离法与免疫荧光法均证实DAXX主要定位在MCF-7细胞核,转染LV-DAXX-GFP慢病毒质粒主要上调了 MCF-7细胞质内DAXX的表达,而转染LV-DAXX-RNAi-GFP慢病毒质粒则主要下调了 DAXX在MCF-7细胞核内的表达;流式细胞术证实下调DAXX的核内表达可以使MCF-7细胞凋亡率上升,细胞增殖受抑,并将细胞阻滞在S期,而上调DAXX的细胞质内表达对MCF-7的细胞凋亡、细胞周期和细胞增殖均无显著影响.结论 DAXX在乳腺癌MCF-7细胞中主要定位在细胞核,DAXX表达于细胞核或者细胞质可能对MCF-7细胞功能有着相反的作用.

目的 构建含有ki-67启动子的腺病毒Ad-pki-67-E1A-GFP,实现特异在ki-67阳性的脑胶质瘤细胞中复制.方法 利用分子生物学的方法将ki-67启动子序列克隆到pGL3-basic载体中,双荧光素酶报告基因实验检测ki-67启动子活性;将ki-67启动子构建到穿梭质粒,并与辅助质粒共转染293T细胞,重组腺病毒Ad-pki-67-E1A-GFP;Ad-pki-67-E1A-GFP加入到脑胶质瘤细胞中,荧光显微镜观察GFP表达情况,同时实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluores-cence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测细胞中ki-67基因表达、腺病毒复制必需基因E1A表达和病毒拷贝数.结果 克隆的ki-67序列在脑胶质瘤细胞中能够启动报告基因表达;酶切和测序证明ki-67启动子构建到穿梭质粒中,并重组得到腺病毒Ad-pki-67-E1A-GFP;Ad-pki-67-E1A-GFP能够感染脑胶质瘤细胞,并且E1A的表达和病毒拷贝数与细胞中ki-67表达呈正相关.结论 ki-67启动子改造后的腺病毒在脑胶质瘤细胞中复制,为进一步改造用于基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础.

目的:构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型，探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法:设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列，与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒，经酶切及测序鉴定后，进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液，NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液，空白组不加病毒液。转染完成后，荧光显微镜下观察荧光表达，流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性，实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达，流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示，与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均 P < 0.001）。CCK8法显示，与NC组相比，shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均 P < 0.05），24和60 h差异无统计学意义（均 P > 0.05）；shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均 P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（ F值分别为8.168、4.644、1.981，均 P > 0.05），mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（ F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663，均 P ≤ 0.01）。与NC组相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均 P < 0.01），imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均 P > 0.05）。 结论:成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型，PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强，γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。

目的:探讨黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)对胰腺癌恶性细胞生物学行为的影响及其作用机制。方法:通过慢病毒转染技术构建AIM2稳定过表达的胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1，并分别通过定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证AIM2的mRNA及蛋白水平。通过BrdU增殖实验、划痕实验、Transwell侵袭实验、细胞凋亡以及细胞周期实验检测过表达AIM2对胰腺癌细胞株功能的影响。通过转录组测序探究AIM2在胰腺癌中的作用机制并进行验证，使用基因表达差异分析评估多组样本之间的差异，组间差异采用 t检验分析。 结果:慢病毒转染可成功构建AIM2稳定过表达的胰腺癌细胞株。BrdU增殖实验结果表明，BxPC-3和PANC-1细胞LV-AIM2-OE组的增殖能力显著低于LV-NC组(吸光度值：0.502±0.006比0.543±0.005、0.956±0.032比1.235±0.091， t＝5.568、2.903， P<0.05)；划痕及Transwell实验结果表明，过表达AIM2后BxPC-3、PANC-1细胞的迁移[(51.960±4.347)%比(43.070±3.546)%、(33.380±1.562)%比(37.950±2.441)%， t＝1.584、1.578， P>0.05]及侵袭能力[(66.730±2.588)个比(60.800±1.506)个、(119.900±4.410)个比(112.900±2.461)个， t＝1.981、1.399， P>0.05]不受影响；流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期显示，BxPC-3、PANC-1细胞株LV-AIM2-OE组的早期凋亡[(6.073±0.206)%比(2.825±0.111)%、(5.230±0.247)%比(4.165±0.385)%， t＝13.890、2.425， P<0.05)]以及总凋亡[(16.420±0.662)%比(10.650±0.169)%、(25.920±0.829)%比(20.710±2.697)%， t＝8.441、2.116， P<0.05]比例均显著高于LV-NC组，并且AIM2过表达后可改变细胞周期分布。转录组测序(RNA-Seq)结果显示，BxPC-3和PANC-1细胞LV-AIM2-OE组中蛋白激酶B(Akt)3基因表达水平显著下调；蛋白印迹结果显示，LV-AIM2-OE组的磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平显著低于LV-NC组(0.647±0.027比1.451±0.030、0.408±0.019比0.978±0.026， t＝19.810、17.650， P<0.001)，并且人第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)水平显著高于LV-NC组(0.908±0.099比0.627±0.013、1.231±0.027比0.557±0.016， t＝2.810、21.820， P<0.05)。 结论:磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt信号通路参与调控AIM2过表达BxPC-3和PANC-1胰腺癌细胞株的生物学功能，从而抑制其增殖能力，促进细胞凋亡，改变细胞周期分布。

皮肤创面形成后，内源性电场（EF）引导表皮细胞向创面中心定向集体迁移，从而促进创面愈合。这一过程涉及2个功能不同的细胞群体，即领导细胞（leader cell）和随从细胞（follower cell）。在EF引导的集体迁移中，领导细胞的定向极化至关重要，但其潜在的调节机制尚不清楚。陆军军医大学（第三军医大学）西南医院整形外科张家平教授团队在《Burns & Trauma》杂志上发文《CD9 negatively regulates collective electrotaxis of the epidermal monolayer by controlling and coordinating the polarization of leader cells》。研究者首先利用延时显微镜观察到EF以电压依赖的方式引导人永生化KC——HaCaT单层向电场阳极集体迁移；在HaCaT单层的前端，领导细胞沿着迁移的方向动态形成伪足。免疫荧光染色显示，EF处理组HaCaT细胞中极化的F?肌动蛋白较对照组增加了3.4倍（P<0.05），证实极化的F?肌动蛋白在伪足形成中发挥重要作用。接着，研究者观察到CD9在HaCaT细胞膜上与F?肌动蛋白共定位；并且EF处理组HaCaT细胞的CD9水平较对照组显著降低（P<0.01）。随后，研究者利用过表达CD9的重组腺病毒转染，构建了过表达CD9的HaCaT（Ad?CD9），并观察到CD9的过表达会抑制EF引导下领导细胞中F?肌动蛋白的极化和HaCaT单层的集体迁移（P<0.001）。研究者进一步探究其机制，证实EF通过下调CD9以激活ADAM17/肝素结合表皮生长因子（HB?EGF）/EGF受体，引起F?肌动蛋白的极化，从而诱导领导细胞的产生，并促进细胞的定向集体迁移。最后，在正常HaCaT细胞和Ad?CD9混合的共培养单层中，研究者观察到CD9过表达导致的领导细胞极化障碍能够恢复至正常细胞水平（P<0.01）；然而，加入HB?EGF中和抗体后，领导细胞再次出现极化障碍（P<0.01）。综上，该文首次揭示了EF引导的HaCaT单层集体迁移的机制，也为急慢性创面的治疗提供了潜在的靶点。

目的:评价抑制Ras相关的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1）表达对高糖诱发神经元损伤的影响。方法:对数生长期PC12细胞接种于6孔板，采用随机数字表法将细胞分为4组（每组3孔）：正常浓度葡萄糖组（C组）、高浓度葡萄糖组（HG组）、高浓度葡萄糖+慢病毒抑制Rac1组（HG+shRac1组）、高浓度葡萄糖+慢病毒阴性对照组（HG+NC组）。C组以葡萄糖浓度为4.5 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG+shRac1组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用Rac1 shRNA慢病毒载体转染的PC12细胞24 h，HG+NC组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用阴性慢病毒载体转染的PC12细胞24 h。Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3）Ⅰ、LC3Ⅱ、Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3 （Bcl-2/adenovirus E1B protein-interacting protein 3, BNIP3）和p62蛋白水平，并计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ；CCK-8法检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡率；二氢溴化乙啶法检测细胞活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平；荧光定量PCR法检测自噬相关基因7 (autophagy-related gene 7, Atg7）、三磷酸腺苷酶6 （adenosinetriphosphatase 6, ATPase6）和60S核糖体蛋白L13 （60S ribosomal protein L13, Rpl13）相对表达量，并计算ATPase6/Rpl13。结果:与C组比较，HG组和HG+NC组ROS水平和细胞凋亡率升高（ P<0.05），细胞活力下降（ P<0.05）；与HG+NC组比较，HG+shRac1组ROS水平和细胞凋亡率降低（ P< 0.05），细胞活力升高（ P<0.05），Atg7相对表达量和BNIP3蛋白水平升高（ P<0.05），p62蛋白水平降低（ P<0.05），LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高（ P<0.05），ATPase6/Rpl13降低（ P<0.05）。 结论:抑制Rac1可减轻高糖诱发的神经元损伤，其机制可能与增强线粒体自噬有关。