结合形态学与ITS序列分析对7株野生虫草真菌进行分类鉴定.MTT法分析它们的菌丝体醇提取物对肝癌HepG2细胞增殖的抑制活性.鉴定结果表明菌株MF7、MF9、MF14为细脚棒束孢Isaria tenuipes,菌株MF11、MF12、MF13为蝉棒束孢Isaria cicadae,菌株MF10为球孢白僵菌Beauveria bassiana;MTT结果显示分离到的3株细脚棒束孢和3株蝉棒束孢的菌丝体醇提取物对HepG2的抑制活性较差,IC50均大于500μg/mL;球孢白僵菌MF10对HepG2细胞有一定抑制作用,IC50值为221.6μg/mL,略强于蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝粉产品金水宝胶囊(IC50=364μg/mL)和中华被毛孢发酵菌丝粉产品百令胶囊(IC50=268.7μg/mL).另外,发现供对比试验的3株蛹虫草菌株(MF1、MF5、MF15)对HepG2细胞均有较好的抑制作用,其中MF15的发酵菌丝体醇提取物活性最强,IC50为55.56μg/mL,暗示蛹虫草发酵菌丝体具有重要的研究价值.

目的:建立蝉拟青霉/黄芪药材、黄芪药渣双向发酵体系,探究发酵过程中有效成分含量变化.方法:选取正交设计法对接种量、发酵温度、湿度进行优化,并采用硫酸-苯酚比色法、NaNO2-Al(NO3)3比色法及香草醛-高氯酸氧化法对发酵黄芪及黄芪药渣菌质中的多糖、总黄酮、总皂苷的含量进行测定.结果:药材菌质最优发酵条件为温度26℃,湿度90％,接种比例3 mL/5 g,药渣菌质最优发酵条件为温度26℃,湿度80％,接种比例3 mL/5 g;经发酵后,黄芪药材菌质中多糖、总皂苷含量略减少,而黄酮含量有所增加;黄芪药渣菌质中黄酮、皂苷含量均增加.结论:蝉拟青霉可对黄芪药材和药渣基质进行发酵,且发酵后菌质中有效成分的得率显著增加,增强了黄芪药材的药用价值,并为药渣的处理提供了新的思路.

抗菌肽是昆虫天然免疫的重要成分,在抵御病原物的侵染中发挥着重要的作用.昆虫Gloverin抗菌肽是一类仅在鳞翅目昆虫中存在的富含甘氨酸抗菌肽.本研究在转录组测序的基础上对小菜蛾抗菌肽gloverin like基因进行了克隆,其开放阅读框序列全长519 bp,编码172 aa,信号肽为1-17 aa.序列分析表明其序列中甘氨酸的比例为15％,与鳞翅目昆虫Gloverin抗菌肽具有较高的同源性.qRT-PCR结果表明小菜蛾抗菌肽gloverin like基因在脂肪体和血细胞组织中表达量较高.蝉拟青霉、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均可诱导小菜蛾抗菌肽gloverinlike基因上调表达,蝉拟青霉诱导12 h后表达量达到最高.利用LC-MS方法在蝉拟青霉侵染的小菜蛾幼虫血淋巴中鉴定出小菜蛾Gloverin like、Gloverin抗菌肽以及Lysozyme Ⅱ、Transferrin、Prophenoloxidase等抗菌效应蛋白.与对照相比,蝉拟青霉侵染后小菜蛾Toll通路4个免疫基因(βGBP、Toll、Cactus和Dorsal)表达量上升.本研究在抗菌肽方面为进一步研究小菜蛾抵御病原真菌入侵的分子机制提供基础信息,也为新的害虫防治方法提供了思路和靶标.

采用液体发酵蝉拟青霉,对蝉拟青霉的发酵条件进行优化,以提高蝉拟青霉胞外多糖产量及生物量.摇瓶发酵条件下,在单因素基础上设计正交实验确定各因素的最佳组合.优化后得最佳发酵培养基:蔗糖8％,牛肉膏0.75％,酵母膏0.125％,MgSO4·7H2 O 0.3％,KH2 PO40.2％,麸皮0.5％.该条件下胞外多糖产量为5.96 g/L,生物量为42 g/L,较优化前提高了1倍.采用发酵罐进行扩大培养,对分批发酵时的初糖浓度进行了优化,并分析了补料分批发酵对发酵过程的影响.发酵罐培养时最适初糖浓度为5％,此时生物量最高为38 g/L,多糖含量最高为5.5 g/L;采用补料分批发酵时,多糖产量最高为5.89 g/L,生物量最高为40 g/L,效果优于分批发酵.

目的:探索中药壁虎经蝉拟青霉发酵后菌质粗提物中蛋白质及体外抗肿瘤活性的变化.方法:分别用冻融、超声、Tris-HC1提取壁虎和壁虎/蝉拟青霉菌质抗肿瘤活性成分,通过蛋白质浓度检测、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析壁虎发酵前后蛋白含量与分子量的变化;MTT检测壁虎发酵前后抗HepG2肿瘤细胞活性的变化及不同提取方式抗肿瘤活性的差异.结果:壁虎发酵后菌质3种提取方式所得蛋白质含量均减少约30％,分子量＞10 kDa的蛋白电泳条带均消失;体外抗HepG2肿瘤细胞增殖活性增加,且超声提取物诱导HepG2肿瘤细胞凋亡的IC50值为10.769 mg·mL-1,比发酵前降低了约50％.结论:蝉拟青霉的生长代谢分解了壁虎中的部分蛋白,且壁虎经蝉拟青霉发酵后抗HepG2细胞增殖活性增强.

[目的]建立能够有效提高蝉拟青霉液体培养效率的培养体系,增加其生物量.[方法]以蝉拟青霉生物量作为响应值,通过Plackett-Burman实验设计从8个试验影响因素中筛选出3个主要影响因素,基于3因素3水平的Box-Behnken设计法以及响应面分析法研究影响蝉拟青霉液体培养各因素之间的交互作用.[结果]通过Plackett-Burman设计法确定影响最为显著的因素为接种量、pH和温度,利用最陡爬坡试验确定最佳范围在接种量7％、pH 6.00、温度25℃附近,借助Box-Behnken设计法最终确定最佳液体培养条件为:葡萄糖20 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母膏2g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、接种量6.65％、pH 6.00、温度24.01℃.优化后的培养体系所培养的蝉拟青霉其生物量从优化前的147.106 0g/L提高到239.475 3g/L,提高了62.79％.[结论]优化后的培养体系能够有效提高蝉拟青霉生物量,该方法对于优化蝉拟青霉生物量发酵条件是一种有效、可行的方法.

目的:利用蝉拟青霉对黄芪进行发酵处理,探究发酵后所得菌质有效成分含量变化及其抗高尿酸血症活性.方法:采用硫酸-苯酚比色法、NaNO2-Al(NO3)3比色法、酸碱滴定法对黄芪及黄芪发酵菌质中多糖、总黄酮、总酸的含量进行测定;采用氧嗪酸钾盐诱导高尿酸血症(HUA)大鼠模型,将雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、菌质(150、300 mg·kg-1)组、黄芪(150、300 mg·kg-1)组及苯溴马隆(20 mg·kg-1)组,连续灌胃给药14 d,分别对大鼠血清中的尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、丙氨酸转氨酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST)水平进行测定.结果:黄芪药材经蝉拟青霉双向发酵后,总多糖的含量显著升高,总黄酮的含量显著降低,总酸的含量变化不明显.与对照组比较,模型组大鼠血清中UA、BUN、TC、TG、ALT和AST水平显著升高(P<0.05,P<0.001);与模型组比较,黄芪组及黄芪发酵菌质组大鼠血清中UA、BUN、TC、TG、ALT和AST水平显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001),且菌质组效果明显优于黄芪组.结论:黄芪经蝉拟青霉发酵后有效成分含量发生较大变化,所得蝉拟青霉/黄芪双向发酵菌质具有良好的抗高尿酸血症作用.

蝉花是我国重要药用真菌,但长期以来其名称特别是学名的使用一直混乱.本文从古代医药典籍记载确认,"蝉花"是历史最久、使用最广的中名,对于其他中名具有优先权.其学名Isaria cicadae系Miquel(1838)根据巴西标本命名,但模式标本己失,原描述文字及插图均极其简单,与蝉花形态差异较大.其有性型迄今未发现,曾先后被认为是小蝉草Ophiocordyceps sobolifera和大蝉草Tolypocladium dujiaolongae(=Cordyceps cicadae Shing).本文根据文献考证澄清了国内外关于小蝉草和大蝉草的误用,分析了长期以来大量日本文献中的命名混乱对我国认知蝉花的影响,并质疑I.cicadae在中国及其他地区的分布,提出它是一复合种,因此蝉花的分类地位及学名需要进一步研究.

[目的]研究蝉拟青霉产镇痛组分的最佳液体发酵培养条件.[方法]采用Plackett-Burman试验设计对液体培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、KH2PO4和MgSO4以及发酵过程中pH、温度和接种量8个因素进行变量分析,筛选出了重要的影响因子为培养基pH、发酵温度和接种量;通过最陡爬坡试验得到这些因子的最大响应值区域.[结果]应用响应面方法分析得到最佳培养条件为:葡萄糖20 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母浸膏2 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4 0.5 g/L、pH 7.96、温度16.05℃及接种量9.27％.[结论]优化后得到的镇痛组分含量是原条件的7.633倍,为该菌株镇痛组分的工业化发酵生产奠定了较好的基础.

[目的]考察蝉拟青霉5704s菌丝体提取液的降血糖作用,探索发挥降血糖作用的主要功能组分.[方法]制备蝉拟青霉5704s菌丝体提取液,分离提取液中峰1、峰2蛋白,采用小鼠试验和体外试验测定菌丝体提取液以及不同活性组分的降血糖作用,SDS-PAGE电泳测定主要降血糖组分分子量.[结果]蝉拟青霉5704s菌丝体提取液具有较好的降血糖作用,血糖下降率为36.85％;体外试验中,提取液峰1蛋白的α-糖苷酶抑制率为71.23％,峰2蛋白的抑制率为63.17％;小鼠试验中,提取液峰1蛋白的血糖下降率为40.23％,峰2蛋白的血糖下降率为25.70％;体外试验和小鼠试验均表明提取液峰1蛋白的降血糖效果优于峰2蛋白,峰1蛋白的分子量为57 781 Da.[结论]确定蝉拟青霉5704s菌丝体提取液中发挥主要降血糖功效的组分是峰1蛋白.