[目的]明确转Bt基因抗虫水稻在病虫害胁迫下对Bt蛋白表达量的影响.[方法]以Bt水稻T1C-19(表达Cry1C蛋白)为研究对象,探究褐飞虱、白叶枯病等 6 种水稻常见病虫害胁迫下其体内Bt蛋白的表达量变化.[结果]褐飞虱取食引起T1C-19 水稻叶片中Bt蛋白含量降低,而黑尾叶蝉取食显著降低了T1C-19 水稻叶鞘中的Bt蛋白含量,白叶枯病侵染导致Bt水稻叶鞘中的Bt蛋白含量显著上升.二化螟、水稻普通矮缩病、稻瘟病的胁迫对转基因水稻T1C-19 叶片和叶鞘中的Bt蛋白含量均无显著影响.[结论]病虫害胁迫因种类不同对Bt水稻中Bt蛋白表达量的影响有所不同.这将为Bt水稻的抗虫效果评价提供数据基础,同时为Bt水稻病虫害综合治理提供科学依据.

近年来,大气CO2浓度升高等全球气候变化和转Bt作物非靶标害虫抗虫性等问题备受关注.大气CO2浓度升高直接或间接地影响植食性昆虫,而迄今为止有关大气CO2浓度升高对刺吸式昆虫(同时也是转Bt作物的非靶标害虫)的影响结论不一,且对其刺吸取食行为的影响研究少有报道.本研究利用智能人工气候箱设置CO2浓度,研究大气CO2浓度倍增(800.μL·L-1)对转Bt水稻的非靶标害虫褐飞虱取食行为及其生长发育和繁殖等的影响.结果表明:大气CO2浓度倍增对褐飞虱卵和若虫历期、成虫体质量和寿命,以及4龄和5龄若虫的刺吸取食行为等都具有显著影响,但对其繁殖力影响不显著.与对照CO2浓度(400μL·L-1)相比,倍增CO2浓度处理下褐飞虱的卵和若虫历期及雌成虫寿命分别显著缩短了4.0％、4.2％和6.6％;长翅型成虫比例显著增加了11.6％;初羽化成虫体质量降低,且雌成虫体质量显著降低了2.2％;此外,倍增CO2浓度处理下褐飞虱4龄和5龄若虫口针的刺探效率都显著增加;其中,N4b波的持续时间分别显著延长了60.0％和50.1％,频次分别显著增加了230.0％和155.9％.可见,CO2浓度倍增可通过提高褐飞虱的刺吸取食而促进其生长发育,并缩短其世代历期、提高长翅成虫比例,最终导致大气CO2浓度升高下转Bt水稻的非靶标害虫褐飞虱发生危害严重,并面临其迁飞扩散为害加重的风险.

[目的]二化螟是水稻的重要害虫之一,钙黏蛋白(cadherin,CAD)是一类重要的Bt杀虫蛋白受体,在获得二化螟钙黏蛋白基因(CsCAD1)的基础上,明确CsCAD1蛋白与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力.[方法]利用PCR技术克隆CsCAD1基因片段,将构建的pET-28a-(+)-CsCAD1重组质粒转入原核表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达.目的蛋白经Ni柱亲和纯化后SDS-PAGE电泳检测,利用western blot和ligand blot技术分析其与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力.[结果]重组载体可在表达菌株BL21中表达一个约44 ku的蛋白,原核表达载体构建成功.SDS-PAGE显示该蛋白条带单一,且纯度较好.Ni柱亲和层析纯化该目的蛋白后进行Ligand blot分析,结果显示CsCAD1重组蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合.[结论]CsCAD1蛋白可以与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白结合,是潜在的Cry蛋白受体,所得结果有助于阐明Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对二化螟的作用机制.

随着转基因技术的飞速发展,越来越多的转基因作物新品种被培育成功并得以推广应用,但转基因作物对非靶标生物的生态安全性问题日益引起人们的广泛关注.为加强转基因作物的生态风险评估,以Cry1Ab纯合基因型转Bt(Bacillus thuringiensis)水稻“克螟稻”和Cry1Ab/Ac融合基因型转Bt水稻“华恢1号”及其对照亲本水稻稻田土壤螨类为研究对象,系统调查研究了纯和基因型和融合基因型转Bt水稻种植下土壤螨类的群落组成、数量动态及其群落多样性的变化.研究结果显示,转Bt水稻对土壤螨类的群落组成无负面影响,仅一些稀有类群(＜1％)和常见类群(介于1％和10％)消失或出现.且与对照亲本相比,纯和基因型转Bt水稻中仅上罗甲螨科(Epilohmanniidae)上罗甲螨属(Epilohmannia)的百分比含量显著增加了525％.此外,转Bt水稻与其对照亲本稻田土壤螨类的数量动态、群落多样性、群落均匀度和科属丰富度之间均差异不显著(P＞0.05).而与纯合基因型转Bt水稻相比,融合基因型转Bt水稻可显著提高大田土壤螨类的数量和科属丰富度(P＜0.05).可见,融合基因型转Bt水稻种植比纯合基因型转Bt水稻更有利于土壤螨类等非靶标生物的发生及其生物多样性保护.

旨在研究多价Bt抗虫转基因水稻的简便有效的检测方法.根据3个Bt转基因事件的插入位置,设计引物,通过多重引物PCR技术,利用9条引物得到6条大小存在明显差异的条带,同时检测3个Bt基因的转基因情况.水稻3个Bt抗虫基因(cry1Ab/Ac、cry2A、cry1C)分别来源TT51-1、T2A-1和T1C-19,其中代表TT51-1事件插入的阳性、阴性条带大小分别为937 bp、718 bp;代表T2A-1事件插入的阳性、阴性条带大小分别为600 bp、434 bp;代表T1C-19事件插入的阳性、阴性条带大小分别为495 bp、792 bp;通过琼脂糖凝胶电泳能快速对转Bt基因插入事件水稻的纯合、杂合、阴性进行检测.该技术克服了多重引物之间可能存在的引物间的相互干扰的技术难度,对不同的PCR试剂有很好的兼容性,可配合水稻DNA的快速提取,迅速对大量选育后代进行分析.该方法的建立为利用多价Bt基因进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便高效的基因检测技术,有助于提高Bt基因检测效率,加快抗螟虫水稻的育种进程.

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda近期在中国为害猖獗,由于繁殖速度快,迁飞能力强,在本土呈现爆发趋势,严重为害了我国农作物.与本地近缘物种斜纹夜蛾Spodoptera litura相比,草地贪夜蛾更偏好玉米、水稻、小麦等禾本科农作物,且对多种化学杀虫剂及转基因Bt玉米产生抗性.寄主适应性以及杀虫剂抗性与解毒代谢相关蛋白密切相关.因此,本研究对这两种夜蛾科害虫的解毒代谢相关蛋白——细胞色素P450、谷胱甘肽转移酶(GST)及ABC转运蛋白进行了全基因组水平系统的搜集和数目比较,构建系统发育树并对P450和GST部分基因扩张分支进行氨基酸差异位点分析.结果显示,在草地贪夜蛾中共鉴定出213个P450基因、58个GST基因、102个ABC基因,其中P450基因与GST基因数目远远多于斜纹夜蛾(116,37),而ABC基因数目与斜纹夜蛾(99)接近.系统发育树分析表明,草地贪夜蛾P450在CYP6、CYP9以及CYP4功能簇,GST在部分进化分支上都发生了显著基因扩张,发生显著扩张的基因中有数个氨基酸突变,其中一些突变被预测可能影响蛋白质功能.但出乎意料的是,ABC亚家族B和E在斜纹夜蛾聚集成簇并发生了显著的基因扩张现象.以上结果暗示入侵种草地贪夜蛾和本地近缘物种斜纹夜蛾在抗性方面可能发展出各自独特的应对机制.本研究为解析草地贪夜蛾解毒抗性特征机制提供基因数据,为草地贪夜蛾的生物防治及抗性研究提供参考依据.

外源蛋白在环境中的残留与积累是转Bt基因作物环境安全评价的重要内容之一.我国已育成多个具有商业化前景的Bt稻品系,但目前多年种植Bt稻后Bt外源蛋白是否会在土壤中积累还不清楚.本研究在同一试验田连续9年种植了转cry1Ab/1Ac基因明恢63(华恢1号)和转cry2A基因明恢63水稻,采用酶联免疫吸附法(ELISA)跟踪监测了分蘖期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量变化,试验第1年(2012年)和最后1年(2020年)还测定了苗期、开花期和成熟期根际土中外源蛋白含量.结果 表明:2012年,转cry1Ab/1Ac基因明恢63在苗期、分蘖期、开花期、成熟期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量分别为1.25、1.77、1.97、1.71和0.30 ng·g-1,2020年分别为1.30、1.69、2.03、1.77和0.43 ng·g-1;2012年,转cry2A基因明恢63在苗期、分蘖期、开花期、成熟期和收获后60 d根际土中外源蛋白含量分别为0.91、1.52、1.53、1.37和0.12 ng· g-1,2020年分别为0.95、1.43、1.61、1.40和0.15 ng·g-1.多因素方差分析显示,时间效应对Bt外源蛋白积累不显著,而品种和生育期效应显著.Bt稻生长过程中根际土中可以检测出微量的Bt外源蛋白,但收获后60 d已经基本降解完毕,根际土中Bt外源蛋白含量不会随着种植时间的增加而累积.