目的 构建Tet-on调控小鼠肝脏特异性表达uPA基因的NOD-SCID背景的转基因小鼠,并通过人肝癌细胞移植修复小鼠亚急性肝损伤进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠.方法 采用CRISPR/Cas9技术,在gRNA引导下,Cas9核酸内切酶于Rosa26基因位点切割并编辑,插入目的基因pTight-uPA-pA-Alb promoter-rtTA-pA表达框.使目的基因能跟随染色体稳定遗传,生物学功能保持稳定.新培育的转基因小鼠分为4组:诱导组(n=17)、移植组(n=16)、未诱导组(n=5)和空白对照组(n=5).诱导组经强力霉素诱导3周,肝脏中表达的uPA能造成小鼠肝脏亚急性损伤;再通过人肝癌细胞移植修复.移植4周后,通过小鼠血清生化学、组织病理学,评估该人源化肝细胞嵌合小鼠的效果.结果 诱导组小鼠血清中uPA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)均高于未诱导组和空白对照组(P＜0.01);移植组人白蛋白含量显著高于未移植组(P＜0.01).组织病理学HE染色发现人肝癌细胞参与小鼠肝组织的修复,激光共聚焦显微镜观察显示鼠肝脏中有人肝癌细胞聚集并表达人白蛋白,组化染色人角质蛋白(CK18)表达成阳性.结论 新构建的转基因小鼠能通过强力霉素诱导小鼠肝脏中uPA表达,造成肝脏亚急性损伤,并通过人源肝癌细胞移植修复进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠.

目的 鉴于肺部疾病的高发病率以及活体动物实验在揭示生物现象方面的优势,建立一套利用共聚焦显微镜进行小鼠肺部活体原位成像的方法 .方法 将10只BALB/c雄性小鼠随机分为A、B两组,每组各5只.利用自制的稳定装置,控制小鼠局部肺组织的运动以获取稳定的观察面,然后用激光共聚焦显微镜进行视频拍摄(5 min).拍摄过程中,A组小鼠经尾静脉注射异硫氰酸荧光素-葡聚糖,B组注射绿色荧光蛋白-血小板(经tie2-cre&rosa26-tomato-EGFP转基因black C57雄性小鼠的血液提取),A组用于观察肺部灌注情况以及该方法对肺组织的损伤情况,B组用于观察血小板运动的情况.结果 通过该套方法 获得了肺组织结构清晰、稳定的图像,随时间推移,5只小鼠第0、30、60、120、180和300秒这6个时间点肺泡面积的均值依次为(1 603±181)、(1 588±183)、(1 528±363)、(1 506±353)、(1 437±369)、(1 549±307) μm2,肺泡大小未随时间变化(P＞0.05);视频画面流畅,血小板的快速运动均被记录而且颗粒清晰、无拖尾;观察结束后,苏木精-伊红染色显示肺组织无明显损伤.结论 该套方法 可用于小鼠肺部活体状态下微循环系统的观察和研究,为其他肺部疾病在活体状态下的研究提供了方法学基础.

背景:近年来关于脂肪型脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein 4,FABP4)的研究已经很多,但肺中FABP4的表达情况与功能仍不明确.目的:探究FABP4在肺中的表达情况和功能.方法:利用FABP4 Cre;Rosa26-tdTomato小鼠示踪红色荧光蛋白表达以及免疫荧光染色共定位系统性地研究了FABP4在肺中的表达情况,并构建FABP4 Cre;iDTR转基因小鼠通过注射白喉毒素特异性去除肺部表达FABP4的细胞,初步探究FABP4在肺中的功能.结果与结论:FABP4能标记成年小鼠肺部的巨噬细胞、无纤毛(clara)细胞、Ⅱ型肺泡细胞、PDGFRα和vimentin阳性间质细胞,但不能标记平滑肌细胞和纤毛(ciliated)细胞.另外,当去除肺部表达FABP4阳性细胞时会出现小鼠无纤毛(clara)细胞及纤毛(ciliated)细胞比例减少的表型,推测可能是去除了FABP4阳性干细胞特性细胞后影响了肺部无纤毛(clara)细胞的增殖与自我更新.该研究比较全面地揭示了FABP4在小鼠肺中的表达情况,并初步探究了FABP4在肺中的作用,为肺的免疫反应及稳态维持等相关研究奠定了一定的基础,并可能成为肺部疾病治疗的潜在靶点.

基因组DNA发生双链断裂(double strand break,DSB)后主要通过同源定向修复(homologous-directed repair,HDR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)两种途径进行修复,其中单链寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide,ssODN)介导的同源定向修复是动物基因组常用的基因组定点修饰技术,具有较大的科研和应用价值.为提高猪基因组ssODN介导HDR效率,本研究以猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)为研究对象,利用丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)抑制剂PD0325901培养细胞,研究其对HDR效率的影响及作用分子机理.结果显示,PD0325901能显著提高PFFs的G2期和S期细胞群百分比,减少G1期细胞群比率,促进HDR修复因子的表达.在最适浓度250 nmol/L时,PD0325901使ssODN介导的GFP报告载体的修复效率提高了58.8％;同时使PFFs基因组位点DMD和ROSA26定点修饰效率分别提高了48.16％和17.64％.本研究表明,MEK抑制剂PD0325901能显著提高猪基因组ssODN介导的同源定向修复效率,为高效制备定点基因修饰动物模型提供了新思路.

目的 通过CRISPR/Cas9技术获得肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为建立肌肉特异表达Cas9小鼠动物模型奠定基础.方法 设计小鼠Rosa26位点sgRNA并通过体外酶切验证活性,同时使用同源重组构建肌肉特异性同源打靶载体;通过显微注射将Rosa26 sgRNA与Cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通过PCR及测序检测胚胎的编辑情况,同时移植到假孕母鼠体内,待其生产;将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9一起注射到小鼠胚胎,通过PCR检测整合情况.结果 体外酶切实验表明,体外转录的sgRNA与Cas9蛋白联合可对靶位点产生编辑作用;成功构建了肌肉特异性同源打靶载体Donor-SP-px459;通过原核注射获得Rosa26基因编辑胚胎,经移植获得Rosa26基因编辑小鼠;注射同源打靶载体后,成功获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎.结论 利用CRISPR/Cas9技术,成功获得Rosa26基因编辑胚胎和小鼠,并获得了肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为利用基因打靶构建肌肉特异表达Cas9的小鼠动物模型奠定基础.

目的 培育一种HBeAg转基因小鼠新品系.方法 克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组的方式分别在Rosa26基因位点定点插入pliver-HBeAg表达框,获得含有HBeAg基因的表达载体pliver-HBeAg,经酶切得到含有HBeAg基因的线性DNA片段,将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再将其移植入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宫,获得F0代建系小鼠;采用长片段PCR对出生小鼠进行鉴定,共获得HBeAg基因正确同源重组的F0代建系小鼠;F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育获得F1代小鼠,经PCR鉴定及测序确认阳性F1代小鼠;将携带HBeAg基因的F1代转基因小鼠再次回交,对子代小鼠进行PCR基因型鉴定,直至获得纯合子子代转基因小鼠;采用全自动化学发光免疫分析仪、胶体金法和免疫组织化学方法分别检测HBeAg转基因鼠血浆和肝组织中HBeAg和HBeAb的表达.结果 采用CRISPR/Cas9技术共获得56只F0代小鼠,其中2只为正确同源重组的F0代小鼠;F1代小鼠中6只阳性F1代小鼠.截至目前,共获得22只F2代纯合子和29只杂合子HBeAg转基因小鼠.所有HBeAg转基因小鼠外周血中均可检出高浓度的HBeAg蛋白,但未检出HBeAb的表达.而且免疫组化结果显示HBeAg转基因小鼠肝脏肝细胞中可特异性表达HBeAg蛋白.结论 采用CRISPR/Cas9技术成功构建了能在肝脏肝细胞中稳定表达HBeAg蛋白且对HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg转基因小鼠,为HBV的研究提供了新的实验动物模型.

目的:构建肌节同源盒基因1(Msx1)?Cre小鼠模型.方法:基于CRISPR/Cas9技术,设计靶向切割Msx1基因启动子下游的单链向导RNA(sgRNA),并构建包含Cre序列的同源重组片段;构建sgRNA载体质粒,转染至小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3),并在细胞水平验证sgRNA的打靶效率和脱靶情况;将靶向切割Msx1基因的sgRNA、Cre同源重组片段及Cas9蛋白等混合溶液经体外显微注射至C57BL/6J小鼠的受精卵,3周后获得小鼠,利用PCR技术鉴定获得的F0代Msx1?Cre小鼠,并将构建成功的Msx1?Cre模型小鼠与Rosa26R?mTmG模型小鼠交配,进行功能验证.结果:设计的sgRNA能够有效定点切割Msx1基因启动子下游靶位点;成功获得Msx1?Cre小鼠模型;Msx1?Cre模型小鼠与Rosa26R?mTmG模型小鼠交配,子代小鼠免疫荧光结果显示,小鼠绿色荧光蛋白(GFP)特异定位于表达MSX1细胞的细胞膜上.结论:成功构建了Msx1?Cre小鼠模型,可用于示踪Msx1基因以及在表达MSX1的牙间充质细胞中进行条件性敲除或过表达实验来研究牙发育过程中特定基因的功能.

目的 本研究拟构建肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体,为成肌细胞分化研究及肌肉特异表达Cas9小鼠模型制作奠定基础.方法 人工合成肌肉特异启动子SP,替换PX459载体中的CMV启动子,构建肌肉特异表达Cas9载体;载体在C2C12细胞中的编辑效率由XbaI和T7E1酶切检测;在此基础上通过同源重组引入DsRed红色荧光蛋白构建Cas9示踪载体;将示踪载体的SP-Cas9-DsRed部分连接至Rosa26位点左右同源臂之间,构建肌肉特异表达Cas9示踪重组载体;将该载体与PX459-Rosa26共转染至C2C12细胞并进行嘌呤霉素筛选,观察荧光的表达,同时,提取细胞DNA进行PCR鉴定和测序,检测载体在C2C12细胞中的整合情况.结果 酶切鉴定以及对目的片段的测序结果表明,成功构建了肌肉特异表达Cas9载体PX459-Rosa26-SP和肌肉特异同源打靶示踪载体Donor-Cas9-SP-DsRed;XbaI和T7E1酶切实验表明,PX459-Rosa26-SP在C2C12细胞中具有较高的编辑效率;转染后的C2C12细胞出现红色荧光,表明Donor-Cas9-SP-DsRed具有表达活性且在肌肉细胞中特异表达;PCR鉴定和测序结果表明,Donor-Cas9-SP-DsRed在C2C12细胞Rosa26位点成功整合.结论 成功构建了肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体Donor-Cas9-SP-DsRed,在为肌肉特异表达Cas9小鼠模型制备提供载体基础的同时,也为肌肉相关基因疾病的研究与基因治疗提供了新的思路.

目的 应用DNA连接酶Ⅳ(Lig4)的小分子抑制剂SCR7处理中华仓鼠卵巢(CHO)-K1细胞,验证其能否提高CHO?K1细胞中由CRISPR/Cas9介导的外源基因在ROSA26安全位点的定点整合效率.方法 构建靶向CHO?K1细胞ROSA26位点的特异性pX330?sgRNA?ROSA26质粒以及带启动子失活的GFP报告基因同源打靶载体,摸索并确定SCR7在CHO?K1细胞内作用的适宜浓度及处理时间,通过流式细胞术检测SCR7对CHO?K1细胞定点整合效率,同时评价剂量范围内SCR7对细胞凋亡的影响.结果 在CHO?K1细胞中成功构建靶向ROSA26位点的GFP报告系统,该系统可用于验证CRISPR/Cas9介导的定点整合效率;确定了SCR7对CHO?K1细胞作用的合适剂量和处理时间,在该条件下SCR7对CHO?K1细胞无明显细胞毒性;证实了SCR7在剂量范围内能有效提升外源基因在CHO?K1细胞ROSA26位点的整合效率,且对细胞凋亡无明显影响.结论 SCR7能提升CHO?K1细胞定点整合效率,该发现为应用Lig4小分子抑制剂构建具备高效表达外源基因的重组CHO细胞系奠定了基础.

目的 构建细胞、组织特异性过表达一氧化氮合酶(iNOS)基因小鼠模型,观察其基本生理特征,检测该小鼠模型对日本血吸虫寄生适应性的影响,包括虫体的生存发育、产卵及对肝脏病理的影响.方法 采用规律成簇的间隔短回文重复及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术将大鼠的iNOS基因片段定点插入到C57小鼠的Rosa26位点,获得F0代Rosa26CAG-LSL-Rat iNOs杂合子小鼠,再分别与LysMCre、AlbCre、TekCre工具小鼠繁配,构建髓系细胞/内皮细胞/肝脏特异性过表达iNOS基因的基因工程小鼠,即Rosa26CAG-LSL-RatiNOSLysM/Alb/Tek基因工程小鼠,观察其基本生理特征.随后建立日本血吸虫感染动物模型.感染6周后,灌注法收集虫体并计数,采用碱消化法计数沉积在肝脏组织中的虫卵数量,利用苏木精-伊红(HE)、马松(Masson)及天狼星红染色法观察肝脏虫卵肉芽肿及肝纤维化的情况.结果 与C57WT小鼠比较,过表达iNOS基因小鼠的体重、毛色、精神状态及情绪等基本行为学特征差异无统计学意义(P＞0.05).但iNOS基因过表达后会使阳性小鼠的出生率明显减少及引起死亡.在感染日本血吸虫尾蚴后6周,与C57WT小鼠比较,C57LysMiNOS小鼠体内的虫体数量[(28.1±2.2)条/只vs.8条/只]、肝脏沉积的虫卵数量[(84 754±44 232)个/克肝脏vs.13 825个/克肝脏)]、肝脏虫卵肉芽肿炎症反应[小鼠单个视野肉芽肿数量:(7.2±2.7)个vs.(1.3±0.8)个,P＜0.001;小鼠单个肉芽肿面积:(4 865.2±3 661.0)mm2 vs.(1 630.2±984.0)mm2,P=0.012)]及肝纤维化明显较少;C57Alb-iNOS小鼠肝脏虫卵肉芽肿炎症反应[小鼠单个视野肉芽肿数量:(7.2±2.7)个vs.(3.6±1.8)个,P＜0.001;小鼠单个肉芽肿面积:(4 865.2±3 661.0)mm2vs.(1 436.4±1 182.4)mm2,P＜0.001]及肝纤维化明显减轻;而C57Tek-iNOS小鼠体内的虫体数量、肝脏虫卵沉积数量及肝脏病理差异无统计学意义(P＞0.05).结论 表达iNOS的髓系细胞是影响日本血吸虫寄生适应性的重要效应细胞,内皮细胞中iNOS的过表达对日本血吸虫寄生适应性的影响较小,而肝脏中特异性高表达iNOS基因可显著减少日本血吸虫感染引起的肝脏虫卵肉芽肿炎症反应和肝纤维化的形成.