目的 通过验证异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,Icl)蛋白在缺氧和营养缺乏等应激条件下的原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin like protein,Pup)化状态的变化,进而说明Pup-蛋白酶体系统对其进行动态调控.方法 构建耻垢分枝杆菌Icl蛋白表达载体,纯化蛋白,制备Icl抗体;构建持续表达His6-Pup的穿梭载体,导入耻垢分枝杆菌中;分别在有氧,缺氧条件(2、4和6 d)培养,营养缺乏条件(2、4、6和8 d)培养,收集耻垢分枝杆菌菌体,超声破碎后获得总蛋白,通过Ni-NTA柱纯化,获得His6-Pup结合的蛋白;跑SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜后做免疫印迹(Western-blot)实验,分别用抗Pup抗体和抗Icl抗体检测,验证Icl蛋白的表达情况及其被Pup化的状况,所有实验均重复3次.结果 发现在缺氧和营养缺乏条件下Icl蛋白的表达呈现增加的趋势,而Pup化的程度有下降的趋势,Pup化和蛋白浓度变化趋势是相反的.说明细胞在应激条件下需要Icl高表达,因而Pup-蛋白酶体系统对其降解程度选择性的下降,相应提高了细胞内Icl蛋白的浓度,满足细胞在应激反应中的需要.结论 Icl在分枝杆菌细胞的应激过程中发挥重要作用,其浓度随着细胞本身的状态而发生动态变化,这主要是Pup-蛋白酶体系统对它的降解调控发生变化,说明Pup可以动态调控Icl蛋白的浓度水
作者：刘毅；薛玉；张旭霞；李传友
来源：国际呼吸杂志 2015 年 35卷 24期
