目的 探讨靶向抑制核糖体蛋白S6(rpS6)表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体的构建方法及抑制rpS6表达对肺腺癌A549细胞株增殖的影响.方法 合成针对rpS6基因的双链寡核苷酸序列,插入质粒载体pGCsil-GFP,转化大肠杆菌细胞,测序鉴定插入片段;再通过293T细胞转染和慢病毒包装,收集浓缩病毒并感染肺腺癌A549细胞株.流式细胞技术分选强阳性表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞克隆,荧光定量PCR及Western blot检测rpS6基因的mRNA和蛋白干扰效率.体外利用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析抑制rpS6表达对肺腺癌A549细胞株增殖能力的影响.结果 重组pGCsil-sh-r pS6-GFP质粒经测序鉴定示:插入序列与rpS6干扰序列完全符合,证实pGCsil-sh-rpS6-GFP质粒构建成功.sh-rpS6慢病毒稳定感染A549细胞株后,流式细胞技术分选GFP强阳性表达的细胞克隆比率为86.80％.荧光定量PCR与Westernblot检测示:sh-rpS6组的mRNA和蛋白干扰效率分别为(79.72±6.83)％、(83.77±12.13)％.体外增殖实验示:与A549细胞相比,sh-rpS6组在各时间点的OD值较对照组均下降(均P＜0.05).结论 构建的sh-rpS6慢病毒载体能稳定、有效地抑制肺腺癌A549细胞株rpS6的表达,并有效减慢A549细胞株的增殖速度.
作者：陈勃江；李为民；刘丹；张雯
来源：四川大学学报（医学版） 2014 年 45卷 2期
