目的 构建敲减死亡相关蛋白激酶1(shDAPK1)基因的慢病毒质粒及稳转神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y),并检测SH-SY5Y细胞中DAPK1敲减后对细胞凋亡的影响.方法 设计并合成特异性敲减DAPK1基因的上下游引物,将引物退火后与双酶切PLKO.1载体经T4连接酶连接、转化、提取质粒并进行DNA测序,获得重组正确的慢病毒干扰质粒pLKO.1-shDAPK1.将该重组的质粒与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞,72 h后收集慢病毒上清液,感染SH-SY5Y细胞,利用嘌呤霉素进行阳性筛选,得到稳定敲减DAPK1的SH-SY5Y细胞系.利用Western blot检测SH-SY5Y稳转细胞系中DAPK1蛋白以及用1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)处理后的Bax、Bcl-2及Caspase-3的蛋白表达水平,并应用流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡情况.结果 重组pLKO.1-shDAPK1质粒的测序比对结果正确,嘌呤霉素筛选后获得shDAPK1稳转SH-SY5Y细胞系(shDAPK1-SY5Y),该稳转细胞系中DAPK1蛋白表达水平与对照组相比显著下降,此外还上调了Bcl-2蛋白的表达,下调Bax、Caspase-3蛋白的表达且流式检测结果显示该细胞系凋亡发生率明显下降.结论 成功构建了慢病毒敲减质粒pLKO.1-shDAPK1,并建立了DAPK1低表达的SH-SY5Y稳定感染细胞系,明显抑制了细胞凋亡.
作者：秦坤；徐绍业；韩雨；闫建国；夏春波；邵晓云
来源：实用医学杂志 2022 年 38卷 6期
