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背景:趋化素在动脉粥样硬化中的表达水平上调,趋化素可能参与了动脉粥样硬化的病理过程.目的:应用腺病毒介导的RNA干扰技术,构建并有效沉默趋化素基因的表达体,为研究其对动脉粥样硬化机制奠定实验技术基础.方法:以小鼠趋化素基因mRNA序列作为干扰靶点,以腺病毒基因pCD316-ZsGreen-shRNA作为质粒载体,设计4组靶向趋化素基因的shRNA序列,构建靶向鼠趋化素的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,筛选出干扰效果最好的shRNA,并在293T细胞对腺病毒进行包装和滴度测定.体外培养小鼠黑色素瘤细胞B16F10,转染腺病毒形成趋化素基因缺陷性B16F10细胞,用qPCR和Western blot检测感染腺病毒后细胞中趋化素mRNA和蛋白水平.结果与结论:①PCR以及基因测序结果表明Chemerin shRNA腺病毒载体构建成功,腺病毒的滴度为2×1010 PFU/mL,pDC-shRNA4对趋化素基因的抑制效果最显著(P<0.001);③qPCR和Western检测B16F10细胞中趋化素mRNA水平和蛋白水平,结果显示Chemerin-shRNA4达到一定的敲低效果;②表明腺病毒介导的shRNA-Chemerin4可有效沉默B16F10中趋化素基因的表达.

作者:陈婷婷;曹园芝;熊玮;董少红

来源:中国组织工程研究 2018 年 22卷 24期

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作者:
陈婷婷;曹园芝;熊玮;董少红
来源:
中国组织工程研究 2018 年 22卷 24期
标签:
趋化素 腺病毒 RNA干扰 动脉粥样硬化 质粒 基因转染 免疫印迹 组织工程 血管平滑肌细胞
背景:趋化素在动脉粥样硬化中的表达水平上调,趋化素可能参与了动脉粥样硬化的病理过程.目的:应用腺病毒介导的RNA干扰技术,构建并有效沉默趋化素基因的表达体,为研究其对动脉粥样硬化机制奠定实验技术基础.方法:以小鼠趋化素基因mRNA序列作为干扰靶点,以腺病毒基因pCD316-ZsGreen-shRNA作为质粒载体,设计4组靶向趋化素基因的shRNA序列,构建靶向鼠趋化素的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,筛选出干扰效果最好的shRNA,并在293T细胞对腺病毒进行包装和滴度测定.体外培养小鼠黑色素瘤细胞B16F10,转染腺病毒形成趋化素基因缺陷性B16F10细胞,用qPCR和Western blot检测感染腺病毒后细胞中趋化素mRNA和蛋白水平.结果与结论:①PCR以及基因测序结果表明Chemerin shRNA腺病毒载体构建成功,腺病毒的滴度为2×1010 PFU/mL,pDC-shRNA4对趋化素基因的抑制效果最显著(P<0.001);③qPCR和Western检测B16F10细胞中趋化素mRNA水平和蛋白水平,结果显示Chemerin-shRNA4达到一定的敲低效果;②表明腺病毒介导的shRNA-Chemerin4可有效沉默B16F10中趋化素基因的表达.

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