目的:利用中间载体pGEM-T easy vector 构建表达型载体pET15b-EGFP ,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化.方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cDNA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3'端加"A",将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增﹑酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP.用XhoI和BamHI分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP.将正确重组的质粒pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质. 结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从Clontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP.pET15b-EGFP转化感

作者：董晓；王家宁；黄永章；郭凌郧

来源：郧阳医学院学报 2005 年 24卷 6期