目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值.方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断,将其先后克隆入pET-28a表达载体.优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6).制备兔多克隆抗体,建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以健康者血清为对照,检测170例结核患者血清的抗体.结果 重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致.融合蛋白在E.coli BL21 (DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40％.利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到95％以上.Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应.CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000,CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002 μg/mL,患者血清的最佳稀释度为1∶500.检测结果与临床诊断的符合率,ELISPOT＞ ELISA(rCFP10-ESAT6)＞ELISA (kit).结论 CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原,对结核的诊断具有重要参考价值.

作者：许艳；陈海丽；刘晓茜；熊延青；席秀红；宰淑蓓；蔡金凤；卢水华；朱召芹

来源：中国人兽共患病学报 2015 年 31卷 4期