目的：构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体，并将其体外转导大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。方法合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列，经退火形成的DNA双链定向克隆到穿梭质粒pAdTrackCMV中获得pAdTrack-siRaf-1质粒，PmeI线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siRaf-1质粒，后转染HEK293细胞，包装获得pAd-siRaf-1腺病毒颗粒，继而感染原代培养的心肌细胞，通过Western blot方法检测siRNA对Raf-1、NF-κB基因的抑制效率，液体闪烁计数仪测定3 H-亮氨酸（[3 H]-leu）掺入率，用HJ2000图像分析系统测定细胞表面积。结果重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确，制备的病毒感染效率高，携带Raf-1的病毒颗粒能够在蛋白水平有效抑制Ang II诱导心肌细胞Raf-1的表达、细胞表面积及[3 H]-leu的增加并下调Raf-1、NF-κB表达。结论成功构建了pAd-siRaf-1重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，转染心肌细胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表达，抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。
作者：郑亚萍；刘春杰
来源：中国比较医学杂志 2016 年 26卷 4期
