目的 构建丙型肝炎病毒非结构蛋白3(HCV NS3)表达质粒并在大肠杆菌中表达其全长蛋白.方法 克隆HCV NS3的核酸序列3420-5312位点,插入pQE-11质粒的Bam H1限制性酶切位点,将此重组质粒转入大肠杆菌表达,用Western blot方法筛选阳性克隆,将含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统以提高HCV NS3蛋白的表达量.收集培养扩增的大肠杆菌菌体,用卵白溶菌酶裂解,收集含有HCV NS3重组蛋白的不溶性包涵体,将包涵体充分洗涤后,溶于含10 mmol/L二硫苏糖醇的缓冲液中.释放的可溶性蛋白用SDS-PAGE电泳分离、洗脱,用离心过滤方法浓缩,乙醇沉淀,重复洗涤去除内毒素.结果 用此方法克隆的HCV NS3全长基因片段表达的重组蛋白分子量为69 kD.含有额外拷贝的argU、ileY和leuW的tRNA基因的pACYA质粒引入HCV NS3表达系统后,HCV NS3蛋白的产出率可提高10倍以上.此方法生产的NS3纯化蛋白质产量,每升培养物为40 mg.内毒素含量低于20 EU/mg NS3蛋白.结论 HCV NS3与HCV的免疫逃逸及感染的慢性化有密切关系,是HCV的抗病毒治疗和疫苗研究的重要靶点,全长HCV NS3蛋白的体外合成为HCV研究提供了一个有用的工具.
作者：金博；李楠；吴凯；张林；王艳梅；翟俊山；朱超慧；宋久刚
来源：中华临床医师杂志（电子版） 2012 年 6卷 20期
