您的账号已在其他设备登录,您当前账号已强迫下线,
如非您本人操作,建议您在会员中心进行密码修改

确定
收藏 | 浏览715 | 下载105

目的 探讨靶向乙型肝炎病毒(HBV) preC,/C基因的小干扰RNA(siRNA)在人类肝癌细胞系Huh-7细胞和HepG2.2.15细胞中抗病毒基因治疗效果.方法 根据GenBank中HBV(GenBank登录号U95551)基因组序列,设计合成靶向HBV preC/C基因的3个长21核苷酸(nt)的siRNA,设计1个对照的非同源长21nt的siRNA,分别克隆到pU6质粒中,构建3个shRNA表达载体pU6-C1,pU6-C2,pU6-C3和对照pU6-C4;为了检测siRNA功能建立报告基因系统,以pT-HBV1.3为模板,PCR合成目的基因preC/C,克隆到绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pEGFP-N1)中构建携带EGFP报告基因的重组质粒pEGFP-preC/C( E-C).将构建的3个shRNA表达载体与E-C共转染Huh-7细胞,或将该3个shRNA表达载体共转染HepG2.2.15细胞.首先,在Huh-7细胞中使用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测EGFP融合表达细胞计数,评估该shRNA在转染后不同时间对EGFP融合报告基因表达的抑制效应;接着在HepG2.2.15细胞中,运用ELISA检测转染后24、48、72和96 h细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量;免疫荧光技术检测转染后72 h细胞内HBsAg和HBcAg的表达水平;实时荧光定量PCR( real-time PCR)进一步检测HBV mRNA转录产物cDNA的拷贝变化.结果 发现siRNA表达质粒与E-C共转染Huh-7细胞后48 h,与pEGFP-N1单质粒转染相比,pU6-C1,p

作者:边中启;刘霜;刘明秋;肖安;焦晔;严维耀;郑兆鑫

来源:中华医学杂志 2012 年 92卷 11期

知识库介绍

临床诊疗知识库该平台旨在解决临床医护人员在学习、工作中对医学信息的需求,方便快速、便捷的获取实用的医学信息,辅助临床决策参考。该库包含疾病、药品、检查、指南规范、病例文献及循证文献等多种丰富权威的临床资源。

详细介绍
热门关注
免责声明:本知识库提供的有关内容等信息仅供学习参考,不代替医生的诊断和医嘱。

收藏
| 浏览:715 | 下载:105
作者:
边中启;刘霜;刘明秋;肖安;焦晔;严维耀;郑兆鑫
来源:
中华医学杂志 2012 年 92卷 11期
标签:
肝炎病毒,乙型 RNA干扰 基因疗法 Hepatitis B virus RNA interference Gene therapy
目的 探讨靶向乙型肝炎病毒(HBV) preC,/C基因的小干扰RNA(siRNA)在人类肝癌细胞系Huh-7细胞和HepG2.2.15细胞中抗病毒基因治疗效果.方法 根据GenBank中HBV(GenBank登录号U95551)基因组序列,设计合成靶向HBV preC/C基因的3个长21核苷酸(nt)的siRNA,设计1个对照的非同源长21nt的siRNA,分别克隆到pU6质粒中,构建3个shRNA表达载体pU6-C1,pU6-C2,pU6-C3和对照pU6-C4;为了检测siRNA功能建立报告基因系统,以pT-HBV1.3为模板,PCR合成目的基因preC/C,克隆到绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pEGFP-N1)中构建携带EGFP报告基因的重组质粒pEGFP-preC/C( E-C).将构建的3个shRNA表达载体与E-C共转染Huh-7细胞,或将该3个shRNA表达载体共转染HepG2.2.15细胞.首先,在Huh-7细胞中使用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测EGFP融合表达细胞计数,评估该shRNA在转染后不同时间对EGFP融合报告基因表达的抑制效应;接着在HepG2.2.15细胞中,运用ELISA检测转染后24、48、72和96 h细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量;免疫荧光技术检测转染后72 h细胞内HBsAg和HBcAg的表达水平;实时荧光定量PCR( real-time PCR)进一步检测HBV mRNA转录产物cDNA的拷贝变化.结果 发现siRNA表达质粒与E-C共转染Huh-7细胞后48 h,与pEGFP-N1单质粒转染相比,pU6-C1,p

Baidu
map