目的 探讨靶向乙型肝炎病毒(HBV) preC,/C基因的小干扰RNA(siRNA)在人类肝癌细胞系Huh-7细胞和HepG2.2.15细胞中抗病毒基因治疗效果.方法 根据GenBank中HBV(GenBank登录号U95551)基因组序列,设计合成靶向HBV preC/C基因的3个长21核苷酸(nt)的siRNA,设计1个对照的非同源长21nt的siRNA,分别克隆到pU6质粒中,构建3个shRNA表达载体pU6-C1,pU6-C2,pU6-C3和对照pU6-C4;为了检测siRNA功能建立报告基因系统,以pT-HBV1.3为模板,PCR合成目的基因preC/C,克隆到绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pEGFP-N1)中构建携带EGFP报告基因的重组质粒pEGFP-preC/C( E-C).将构建的3个shRNA表达载体与E-C共转染Huh-7细胞,或将该3个shRNA表达载体共转染HepG2.2.15细胞.首先,在Huh-7细胞中使用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测EGFP融合表达细胞计数,评估该shRNA在转染后不同时间对EGFP融合报告基因表达的抑制效应；接着在HepG2.2.15细胞中,运用ELISA检测转染后24、48、72和96 h细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量；免疫荧光技术检测转染后72 h细胞内HBsAg和HBcAg的表达水平；实时荧光定量PCR( real-time PCR)进一步检测HBV mRNA转录产物cDNA的拷贝变化.结果 发现siRNA表达质粒与E-C共转染Huh-7细胞后48 h,与pEGFP-N1单质粒转染相比,pU6-C1,p

作者：边中启；刘霜；刘明秋；肖安；焦晔；严维耀；郑兆鑫

来源：中华医学杂志 2012 年 92卷 11期