目的:构建用于表达具有Tat序列的新型神经营养因子MANF (mesencephalic astrocytederived neurotrophic factor)融合蛋白(Tat-MANF)的重组质粒;利用原核细胞表达系统表达该重组蛋白,并检测其生物学活性.方法:以MANF cDNA为模板,利用PCR技术在上下游分别添加TAT序列和His标签及合适的限制性酶切位点,构建TAT-MANF融合基因.插入表达载体Pet22b+后,转化大肠杆菌BL21进行表达和纯化,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达的重组蛋白.为了验证Tat-MANF的生物学活性,用30μmol/L浓度的6-羟多巴胺(6-OHDA)对神经母胶质瘤细胞(SH-SY5Y)进行毒性诱导,同时加入2μg/ml的TAT-MANF及对照MANF蛋白,24h后用流式细胞仪检测细胞的凋亡率.用脑微血管内皮细胞(B-endo3)体外模拟血脑屏障,与FITC标记的Tat-MANF共孵育4h,荧光显微镜下观察.结果:成功构建TAT-MANF融合基因,表达产物与目的蛋白大小相符,能与MANF抗体发生结合反应.重组蛋白可减少由6-OHDA导致的SH-SY5Y细胞凋亡,Tat-MANF-FITC与B-end3细胞共孵育4h后,可见细胞内明显荧光.结论:获得的重组蛋白Tat-MANF具有神经细胞保护作用及跨膜功能,为进一步开展帕金森症的体内治疗研究奠定了物质基础.
作者：李晨；顾华；郭佳；孙慧；黄经纬；蒋明；靳令经；房健民
来源：中国生物工程杂志 2014 年 34卷 6期
