SAMHD1 蛋白全称为不育-α-基序结构域(SAM 域)和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域(HD 域)包涵蛋白 1 ,是由真核生物 SAMHD1 基因编码的蛋白质.研究发现 SAMHD1 会在许多肿瘤中发生突变,并且它在肿瘤中的突变有功能性意义.SAMHD1 具有 dNTPase 活性,能够调节细胞内dNTP的稳态,进而维持基因组的稳定性,抑制肿瘤的发生和发展.本文将主要对 SAMHD1 抗肿瘤作用的研究进展进行论述.

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.

目的 :探讨不同灵长类动物限制因子不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(SAM HD1)的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素(IFN)产生信号通路等作用,为灵长类动物SAM HD1的研究提供依据.方法 :构建稳定表达不同灵长类动物SAM HD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为阴性对照组,以稳定表达不同灵长类动物SAM HD1蛋白的U937细胞系为实验组.经佛波酯(PMA)刺激分化成巨噬样细胞后,流式细胞术分析各组HIV-1病毒感染率.以单独转染SAMHD1表达质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染SAM HD1与HIV-2/SIV Vpx表达质粒的细胞为实验组,转染后48 h收获细胞,采用Western blotting法检测SAM HD1蛋白表达水平,免疫荧光检测法观察不同SAM HD1蛋白的细胞内定位.以单独转染LINE-1-GFP报告质粒的HEK293T细胞作为对照组,以共同转染LINE-1-GFP与SAM HD1表达质粒的细胞为实验组,采用流式细胞术检测GFP阳性细胞率,代表SAM HD1对LINE-1转座子的活性.以单独转染IFN-luc报告质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染IFN-luc和SAM HD1表达质粒的细胞为实验组,采用化学发光仪检测HEK293T细胞中荧光素酶的表达水平.结果 :与阴性对照组比较,灵长类动物SAM HD1稳定表达的实验组HIV-1病毒感染率明显降低(P<0.01).与对照组比较,实验组灵长类动物SAMHD1蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01).免疫荧光检测,灵长类动物SAMHD1蛋白均定位于细胞核中.与对照组比较,实验组GFP阳性细胞率明显降低,即SAMHD1对LINE-1转座子活性降低(P<0.05或P<0.01).与对照组比较,实验组灵长类动物HEK293T细胞中荧光素酶表达水平明显降低(P<0.05).结论 :不同灵长类动物SAM HD1蛋白具有抵抗HIV-1病毒感染、抑制逆转录转座子LINE-1以及拮抗天然免疫系统产生IFN的作用.

背景与目的:不育α基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein 1,SAMHD1)具有抑制多种肿瘤细胞生长的作用,但其调节肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞增殖的作用及机制尚未见报道.探究SAMHD1调控p27的表达对HCC细胞Huh7的增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法:首先通过蛋白质印迹法(Western blot)检测正常肝细胞和不同类型HCC细胞中SAMHD1的表达情况.利用基因修饰技术构建过表达SAMHD1、dNTP酶活性位点突变体(SAMHD1-D207N)和磷酸化位点突变体(SAMHD1-T592E)的重组质粒,然后利用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测过表达SAMHD1及其突变体或siRNA干扰沉默SAMHD1对HCC细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡情况.在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中分析SAMHD1和p27表达的相关性.结果:HCC细胞中SAMHD1表达上调,过表达SAMHD1、SAMHD1-D207N和SAMHD1-T592E可以抑制Huh7细胞增殖,细胞周期停滞在G1/G0期;相反,干扰SAMHD1后细胞增殖加快,细胞周期停滞在G2/M期.机制研究表明,SAMHD1上调细胞周期蛋白激酶抑制因子p27的表达.在HCC组织中,p27的表达与SAMHD1表达呈正相关.结论:过表达SAMHD1可以上调p27的表达,导致细胞周期停滞在G1/G0期,从而抑制HCC细胞增殖,这种抑制作用不依赖于其dNTP酶活性和磷酸化修饰.

不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain containing protein 1,SAMHD1)是由真核生物SAMHD1基因编码,由626个氨基酸组成的蛋白,总长度1878bp[1],该蛋白主要包含N-端核定位信号区(NLS)、不育α基序(SAM)结构域、组氨酸/天冬氨酸残基(HD)结构域、T592磷酸化位点以及C-端可变区(Vpx结区)[2].