目的:制备缓释万古霉素的多聚乳酸-聚乙二醇-多聚乳酸(PLGA-PEG-PLGA)温敏水凝胶，探讨其理化性能、生物学性能和抗菌性能。方法:PLGA(1 500~2 000)-PEG (1 000~1 500)-PLGA(1 500~2 000)多聚物溶液在4 ℃下孵育7 d，充分溶解后在37 ℃水浴中放置10 min成胶并负载万古霉素。冻干脱水48 h后利用扫描电镜观察其微观结构。在37 ℃、60 r/min条件下利用紫外-可见光谱分析绘制其体外降解曲线及药物释放曲线。以二甲基亚砜(DMSO)作为阳性对照，利用噻唑蓝(MTT)法检测本材料细胞相容性。在37 ℃、120 r/min条件下检测其抗菌效果。两组间比较采用独立样本 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果:抗菌水凝胶扫描电镜结果显示，PLGA-PEG-PLGA抗菌温敏水凝胶具有疏松多孔的微观结构，载药前[(53.77±31.20) μm、后孔隙尺寸[(50.42±27.60) μm]差异无统计学意义( t＝0.255， P>0.05)；体外降解时长30 d；空载水凝胶组[(96.41±2.41)%]、载药水凝胶组细胞活性[(96.98±2.26)%]，与DMSO组[(37.64±2.69)%]差异有统计学意义( F＝1 727.784， P<0.05)；药物释放实验证实万古霉素可以持续释放30 d；抗菌实验结果表明，载药水凝胶可以对金葡菌提供长达72 h的抗菌效果。 结论:PLGA-PEG-PLGA温敏型水凝胶是一种较理想的抗生素载体，无细胞毒性，能够长效缓释负载的抗生素，具有潜在的临床应用价值。

目的:制备改良型富血小板纤维蛋白（A-PRF）/壳聚糖温敏水凝胶（以下简称复合水凝胶）并探讨复合水凝胶对糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面愈合的作用。方法:该研究为实验研究。成功制备具有多孔网状结构及温敏特性的含质量浓度为10、15、20、50、100 g/L A-PRF的复合水凝胶。取6~8周龄雄性SD大鼠，通过腹腔注射链脲佐菌素成功制造糖尿病大鼠模型，并在每只大鼠背部制造4个全层皮肤缺损创面（最终36只大鼠成功造模）。将每只大鼠3个创面分别作为空白组（不进行药物干预）、阳性对照组（滴加重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子凝胶）、壳聚糖水凝胶组（滴加壳聚糖水凝胶溶液）。取其中30只大鼠，将每只大鼠剩余的1个创面共30个创面分为10、15、20、50、100 g/L复合水凝胶组，每组6个创面，分别滴加含10、15、20、50、100 g/L A-PRF的复合水凝胶溶液；取剩余6只大鼠，于每只大鼠剩余的1个创面滴加含100 g/L A-PRF的复合水凝胶溶液。伤后14 d，取其中1个创面滴加含100 g/L A-PRF的复合水凝胶溶液的6只大鼠，行苏木精-伊红（HE）染色，观察大鼠心、肝、脾、肺和肾等炎症、出血或坏死情况；伤后10 d，取其中1个创面滴加含15 g/L A-PRF的复合水凝胶溶液的6只大鼠，采用激光血流成像系统观测4组创面血流灌注量（样本数为6）。伤后7、14 d，计算8组创面愈合率。伤后14 d，取8组创面组织，分别行HE、Masson染色，观察新生上皮形成和胶原生成情况；采用免疫组织化学法检测CD31、血管内皮生长因子A（VEGFA）的阳性表达情况并计算阳性面积百分比；采用蛋白质印迹法检测CD31、VEGFA的蛋白表达；采用实时荧光定量反转录PCR法检测CD31、VEGFA的mRNA表达（样本数均为4）。结果:伤后14 d，6只大鼠心、肝、脾、肺、肾中均未观察到明显的炎症、出血或坏死。伤后10 d，15 g/L复合水凝胶组创面血流灌注量明显多于空白组、阳性对照组、壳聚糖水凝胶组（ P值均<0.05）。伤后7、14 d，空白组创面愈合率分别为（26.0±8.9）%、（75.0±1.8）%，均分别明显低于阳性对照组、壳聚糖水凝胶组及10、15、20、50、100 g/L 复合水凝胶组的（45.8±3.2）%、（49.8±3.7）%、（51.2±2.9）%、（68.5±2.4）%、（68.8±1.5）%、（72.7±2.1）%、（75.0±3.7）%及（79.1±1.9）%、（77.2±1.7）%、（82.3±1.3）%、（89.6±1.9）%、（89.8±1.3）%、（87.3±1.1）%、（87.9±1.3）%（ P<0.05）；阳性对照组、壳聚糖水凝组、10 g/L 复合水凝胶组创面愈合率均明显低于15、20、50、100 g/L 复合水凝胶组（ P<0.05）。伤后14 d，15、20、50、100 g/L 复合水凝胶组创面上皮化程度较其他4组创面更高、新生微血管情况更好，胶原数量更多且排列更整齐。伤后14 d，阳性对照组创面CD31、VEGFA及壳聚糖水凝胶组创面VEGFA阳性面积百分比均明显高于空白组（ P<0.05），10 g/L 复合水凝胶组创面VEGFA阳性面积百分比明显高于空白组、壳聚糖水凝胶组、阳性对照组（ P值均<0.05），15、20、50、100 g/L 复合水凝胶组创面CD31、VEGFA阳性面积百分比均明显高于空白组、阳性对照组、壳聚糖水凝胶组、10 g/L 复合水凝胶组（ P<0.05）。伤后14 d，壳聚糖水凝胶组、阳性对照组、10 g/L 复合水凝胶组创面组织中CD31、VEGFA蛋白和mRNA表达均明显高于空白组（ P<0.05），10 g/L复合水凝胶组创面组织中VEGFA蛋白表达明显高于阳性对照组（ P<0.05）和CD31、VEGFA mRNA表达均明显高于阳性对照组、壳聚糖水凝胶组（ P<0.05），15、20、50、100 g/L复合水凝胶组创面组织中CD31、VEGFA蛋白和mRNA表达均明显高于空白组、阳性对照组、壳聚糖水凝胶组、10 g/L 复合水凝胶组（ P<0.05），壳聚糖水凝胶组创面组织中CD31、VEGFA的mRNA表达均明显低于阳性对照组（ P<0.05）。 结论:复合水凝胶生物安全性高，可改善创面血流灌注，有效促进创面组织中血管和胶原生成，从而促进糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面愈合；15 g/L为复合水凝胶中A-PRF的较优使用质量浓度。

目的:探讨负载蛋白聚糖4(PRG4)的温度敏感性聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯共聚物(PCEC)可注射水凝胶材料表征及修复新西兰兔软骨缺损的效果。方法:2022年3月至2023年6月，利用PCEC温敏性水凝胶负载了PRG4效应因子(PRG4@PCEC)，使用扫描电子显微镜观察冷冻干燥的PRG4@PCEC水凝胶的形貌，测量PCEC和PRG4@PCEC水凝胶的最低共溶温度；使用活/死细胞染色技术评估水凝胶的生物安全性；采用雄性新西兰大白兔18只，36个膝关节缺损样本，随机分为3组，其中12个缺损组用PRG4@PCEC水凝胶修复，12个缺损组用PCEC水凝胶修复，12个缺损组为空白对照组，观察水凝胶的软骨修复能力；通过微型计算机断层扫描(Micro-CT)分析软骨下骨再生，标本组织切片苏木精-伊红(HE)、马松(Masson)染色及荧光定量聚合酶链反应(PCR)评估水凝胶对软骨缺损的修复作用。组间比较采用 t检验。 结果:水凝胶具有明显的多孔微观结构，PCEC和PRG4@PCEC水凝胶分别在35 ℃和38 ℃表现出最低共溶温度；激光共聚焦观察活/死细胞染色结果证明PRG4@PCEC水凝胶对于兔软骨细胞具有良好的生物相容性；载有PRG4的水凝胶组在8周时，缺损已经完全被高含量的新生软骨组织填充，表明软骨缺损修复最佳；Micro-CT显示在8周时PCEC组[(37.33±0.39) mm 3]和PRG4@PCEC组[(25.33±0.21) mm 3]软骨下骨缺损体积均小于对照组[(51.57±0.49) mm 3， t＝32.19、69.56， P<0.01]；切片染色显示PRG4@PCEC水凝胶组软骨下骨有效形成；荧光定量PCR结果显示在4周和8周PCEC组(2.79±0.07、2.18±0.10)与PRG4@PCEC组白细胞介素-1β(IL-1β)表达水平(1.54±0.07、0.80±0.10)均低于对照组(3.21±0.08、2.54±0.07， t＝0.68、4.97、27.63、24.43， P<0.01)，同时PCEC组(0.95±0.24、1.45±0.34)和PRG4@PCEC组Ⅱ型胶原蛋白(COL2)基因表达水平(1.19±0.45、1.53±0.26)高于对照组(0.64±0.07、1.01±0.14， t＝7.47、0.08、10.70、3.12， P<0.05)。 结论:负载PRG4的温度敏感性PCEC可注射水凝胶具有良好的温度敏感性和生物安全性，对关节软骨缺损有明显修复作用。

目的:探讨负载锌离子的复合水凝胶（以下简称含锌水凝胶）对糖尿病小鼠全层皮肤缺损感染创面的作用及其机制。方法:该研究为实验研究。制备聚（甘油癸二酸酯）-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶（以下简称单纯水凝胶）和在单纯水凝胶的基础上添加锌离子的疏松多孔且具有良好黏附性的固态含锌水凝胶。计算用磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡14 d后含锌水凝胶中锌离子的释放率。检测用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养2 h后耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）浓度。利用酶标仪检测单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除率，反映清除氧自由基能力。测量用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养24 h后人脐静脉内皮细胞（HUVEC）形成的血管长度。采用细胞计数试剂盒8检测用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养24 h后L929细胞的活力。将小鼠红细胞悬液分为用PBS处理的空白对照组和用相应溶液处理的单纯水凝胶组、含锌水凝胶组和Triton X-100组，利用酶标仪检测孵育2 h后红细胞的溶血情况并计算溶血率。以上实验样本数均为3。取21只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠，在背部脊柱对称位置各制备1个用MRSA感染的全层皮肤缺损创面。将小鼠分为滴加PBS的空白对照组和用相应水凝胶处理的单纯水凝胶组和含锌水凝胶组。伤后3 d，检测空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面中的细菌浓度，样本数为4。于伤后0（即刻）、3、7、14 d，大体观察小鼠创面感染情况并计算伤后3、7、14 d创面愈合率，样本数为5。伤后14 d，行苏木精-伊红染色和Masson染色分别检测小鼠创面中的新生上皮和胶原生成情况，行免疫荧光染色检测小鼠创面中血管新生及M2型巨噬细胞分布情况。结果:浸泡14 d后，含锌水凝胶中锌离子的释放率为（70.5±4.6）%。与用含锌水凝胶比较，用PBS和单纯水凝胶培养2 h后细菌浓度均明显升高（ P<0.05）。含锌水凝胶对DPPH的清除率明显高于PBS、单纯水凝胶（ P值均<0.05）。与用PBS比较，用含锌水凝胶培养24 h后HUVEC形成的血管长度明显增长（ P<0.05）。与用含锌水凝胶比较，用PBS和单纯水凝胶培养24 h后L929细胞的活力均明显降低（ P<0.05）。孵育2 h后，与Triton X-100组相比，空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组红细胞的溶血率均显著降低（ P<0.05）；而后3组的红细胞溶血率相近（ P>0.05）。伤后3 d，含锌水凝胶组小鼠创面中的细菌浓度明显低于空白对照组和单纯水凝胶组（ P值均<0.05）。伤后3~14 d，3组小鼠创面均逐渐愈合，含锌水凝胶组小鼠伤后14 d创面基本愈合。伤后7 d，含锌水凝胶组小鼠创面愈合率为（72.4±8.4）%，明显高于空白对照组和单纯水凝胶组的（31.6±6.7）%、（44.7±5.4）%（ P值均<0.05）。伤后14 d，含锌水凝胶组小鼠创面愈合率为（92.7±4.3）%，明显高于空白对照组的（73.5±7.4）%， P<0.05。伤后14 d，与空白对照组和单纯水凝胶组相比，含锌水凝胶组小鼠创面的新生表皮长度更长、厚度更厚，胶原沉积更多，新生血管和M2型巨噬细胞分布更丰富。 结论:含锌水凝胶具有良好的生物相容性、清除氧自由基能力和体内外抗菌效果、促血管生成能力，可持续缓释锌离子，促进创面再上皮化及胶原合成，从而促进小鼠全层皮肤缺损感染创面愈合。

目的:观察生物三维打印类细胞外基质(ECM)硬度对骨髓间充质干细胞(BMSC)向皮肤附属器细胞分化的影响。方法:(1)分别将1 g海藻酸钠和4 g明胶、3 g海藻酸钠和8 g明胶混匀，混合物分别溶于100 mL超纯水中，配制2种海藻酸钠-明胶复合水凝胶，分别命名为1A4G水凝胶、3A8G水凝胶，用于后续实验。观察2种水凝胶室温下、4 ℃冷凝15～30 min(冷凝条件下同)后、冷凝且用25 g/L氯化钙溶液交联(交联条件下同)后、冷凝后且用生物三维打印机(三维打印仪器下同)进行三维打印且交联后形态。取2种水凝胶冷凝并交联后，采用杨氏模量测定仪检测杨氏模量(硬度)，样本数为3。取2种水凝胶交联并冷冻干燥，用扫描电子显微镜观察其孔隙结构。取2种水凝胶交联并冷冻干燥，用无水乙醇置换法检测孔隙率，样本数为3。(2)从20只1周龄雌雄不限C57BL/6小鼠股骨和胫骨中分离培养BMSC，取第2代细胞进行实验。分别将1.0×10 7个/mL的BMSC单细胞悬液与1A4G水凝胶、3A8G水凝胶以1∶9的体积比充分混匀，制备载BMSC的1A4G水凝胶、载BMSC的3A8G水凝胶，进行三维打印，1 mL载细胞水凝胶(打印用量下同)打印1块，交联后加入间充质干细胞(MSC)专用培养基培养。根据水凝胶不同，将打印块分为1A4G组和3A8G组。取2组打印块各1块，培养7 d，采用细胞活/死试剂盒计数50倍视野下活、死细胞。取2组打印块各9块，另将9孔用2 mL MSC专用培养基培养的每孔1.0×10 6个BMSC设为二维培养组。分别于培养1、3、5 d，1A4G组与3A8G组各取3块打印块、二维培养组取3孔细胞，用细胞计数试剂盒8法检测培养液中吸光度值，以此表示细胞增殖活性。(3)同实验(2)制备载BMSC的1A4G水凝胶、载BMSC的3A8G水凝胶各10 mL，分别加入从10只新生1 d雌雄不明C57BL/6小鼠提取的足趾垫匀浆液各0.5 mL混匀进行三维打印及交联，加入MSC专用培养基培养3 d，更换为汗腺专用培养基培养。根据水凝胶不同，将打印块分为1A4G组和3A8G组。汗腺专用培养基培养7 d，采用免疫荧光法检测2组打印块中细胞的上皮细胞表面标志物细胞角蛋白5(CK5)和CK14、汗腺细胞表面标志物CK18和钠钾ATP酶(NKA)、毛囊细胞表面标志物CK17和碱性磷酸酶(ALP)蛋白表达，实时荧光定量反转录PCR法检测2组打印块中细胞的CK5、CK14、CK18、NKA(检测ATP1a1转录本)、CK17、ALP mRNA表达(样本数为3)。对数据行独立样本 t检验、Fisher确切概率法检验、析因设计方差分析及Bonferroni法。 结果:(1)与3A8G水凝胶比较，1A4G水凝胶室温下黏度稍低、流动性稍好。2种水凝胶冷凝后均呈凝胶状，在此基础上，交联后形状均匀规则，经三维打印且交联后为固态的纵横交错的圆柱块。1A4G水凝胶杨氏模量为(52±6)kPa，明显低于3A8G水凝胶的(218±5)kPa( t＝40.470， P<0.01)。2种水凝胶孔隙结构相似，横断面均呈多孔网状结构；2种水凝胶的孔隙率相近( t＝0.930， P>0.05)。(2)培养7 d，1A4G组和3A8G组打印块中活、死细胞分布相近( P>0.05)，绝大部分为活细胞。培养1、3、5 d，1A4G组和3A8G组打印块及二维培养组培养液中吸光度值两两比较，差异均无统计学意义( P>0.05)。与组内培养1 d比较，1A4G组、3A8G组打印块培养3、5 d培养液中吸光度值均明显升高( P<0.05或 P<0.01)，二维培养组细胞培养5 d培养液中吸光度值明显升高( P<0.01)；与组内培养3 d比较，1A4G组、3A8G组打印块及二维培养组细胞培养5 d培养液中吸光度值均明显升高( P<0.01)。(3)汗腺专用培养基培养7 d，2组打印块中细胞均可见CK5、CK14、CK18、NKA、CK17、ALP蛋白表达。汗腺专用培养基培养7 d，2组打印块中细胞的CK5、CK14、CK18、NKA mRNA表达量相近( t＝0.362、0.807、0.223、1.356， P>0.05)；3A8G组打印块中细胞的CK17、ALP mRNA表达量分别为1.96±0.21、55.57±11.49，均明显高于1A4G组的1.05±0.42、2.01±0.27( t＝3.333、8.074， P<0.05或 P<0.01)。 结论:1A4G水凝胶和3A8G水凝胶三维培养的BMSC均有向汗腺细胞分化的趋势，但3A8G水凝胶三维培养的BMSC向毛囊细胞分化的趋势比1A4G水凝胶明显。提示相对高的生物三维打印类ECM硬度，不仅有利于BMSC向汗腺细胞分化，还有利于其向毛囊细胞分化。

目的:观察脂肪组织来源的脱细胞基质水凝胶（DAT-gel）对大鼠坐骨神经缺损的修复效果。方法:2019年4月-2020年4月,收集在解放军总医院第一医学中心整形修复科行大腿或腹部吸脂术的健康成年女性的术后废弃无菌颗粒状脂肪组织,术前均获得患者知情同意。对脂肪组织行脱细胞和酶消化处理制备成DAT-gel。扫描电镜（SEM）观察水凝胶的超微结构,流变学测试水凝胶的凝胶动力学和粘弹性。建立大鼠坐骨神经缺损模型,并将其随机分为3组：单纯几丁质导管组（Chitin组）、DAT-gel加几丁质导管组（DAT-gel组）和自体神经反接组（Autograft组）,每组10只动物。术后12周分别对再生神经的大体观、功能学以及形态学等一系列指标进行观察,评估损伤神经的修复情况。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行数据分析,如果组间差异有统计学意义,则进一步采用Turkey法进行两两比较, P<0.05为差异有统计学意义。 结果:SEM检查结果显示DAT-gel凝胶内部呈三维疏松多孔的纤维网络结构。流变学测试结果显示：水凝胶在4 ℃与37 ℃时复数粘度分别为148.91 mPa·s和801.29 mPa·s。DAT-gel随温度增高发生溶胶-凝胶相变结果显示DAT-gel具备良好温敏效应,其溶胶-凝胶相变临界点近似体内温度。动物实验结果显示,术后12周,DAT-gel组的再生神经形态及其功能均优于Chitin组（ P<0.05）。 结论:DAT-gel可能对大鼠坐骨神经缺损的修复具有明显的促进作用。

目的:探讨氧化铈纳米酶-甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶（以下简称复合水凝胶）在小鼠全层皮肤缺损感染创面修复中的作用。方法:该研究为实验研究。采用水热法制备粒径为（116±9）nm的氧化铈纳米酶，同时制备具有多孔网状结构且成胶性能良好的GelMA水凝胶。筛选出25 μg/mL氧化铈纳米酶可明显促进人皮肤成纤维细胞增殖和具有较高的超氧化物歧化酶活性，将其加入GelMA水凝胶中制备复合水凝胶。计算用磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡3、7 d后复合水凝胶中氧化铈纳米酶的释放百分比。将小鼠红细胞悬液分为用相应溶液处理的PBS组、Triton X-100组、氧化铈纳米酶组、GelMA水凝胶组及复合水凝胶组，利用酶标仪检测处理1 h后红细胞的溶血情况。测定用PBS、氧化铈纳米酶、GelMA水凝胶及复合水凝胶培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和大肠埃希菌2 h后的细菌浓度。以上实验样本数均为3。取24只8周龄雄性BALB/c小鼠，在背部对称位置各制备1个用MRSA感染的全层皮肤缺损创面。将小鼠分为不进行药物干预的对照组及滴加相应溶液的氧化铈纳米酶组、GelMA水凝胶组和复合水凝胶组，每组6只小鼠。观察伤后3、7、14 d创面愈合情况并测量伤后3、7 d剩余创面面积（样本数为5）。取小鼠伤后3 d创面分泌物，检测MRSA的浓度（样本数为3），采用激光散斑血流成像系统观测小鼠伤后5 d创面血流灌注量（样本数为6）。伤后14 d，取小鼠创面组织，行苏木精-伊红染色观察新生上皮情况，行Masson染色观察胶原情况（样本数均为3）。结果:浸泡3、7 d后，复合水凝胶中氧化铈纳米酶释放百分比分别约为39%、75%。处理1 h后，与Triton X-100组比较，PBS组、GelMA水凝胶组、氧化铈纳米酶组及复合水凝胶组红细胞溶血程度均明显下降（ P<0.05）。与用PBS培养比较，用氧化铈纳米酶、GelMA水凝胶、复合水凝胶培养2 h的MRSA、大肠埃希菌浓度均明显降低（ P<0.05）。伤后3~14 d，4组小鼠创面均逐渐愈合，复合水凝胶组小鼠伤后14 d创面全部愈合。伤后3、7 d，复合水凝胶组小鼠剩余创面面积分别为（29±3）、（13±5）mm 2，明显小于对照组的（56±12）、（46±10）mm 2和氧化铈纳米酶组的（51±7）、（38±8）mm 2（ P值均<0.05），与GelMA水凝胶组的（41±5）、（24±9）mm 2相近（ P值均>0.05）。伤后3 d，复合水凝胶组小鼠创面MRSA浓度明显低于对照组、氧化铈纳米酶组、GelMA水凝胶组（ P值均<0.05）。伤后5 d，复合水凝胶组小鼠创面血液灌注量明显大于对照组、氧化铈纳米酶组、GelMA水凝胶组（ P值均<0.05）。伤后14 d，复合水凝胶组小鼠创面基本完成上皮化，上皮化情况明显优于其他3组；复合水凝胶组小鼠创面胶原含量较其他3组明显增多，排列也更为有序。 结论:复合水凝胶具有良好的生物相容性和体内外抗菌效果，可持续缓释氧化铈纳米酶，改善早期创面血流灌注，促进创面再上皮化及胶原合成，从而促进小鼠全层皮肤缺损感染创面愈合。

目的:探究负载人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（hUCMSC-sEV）的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶治疗小鼠全层皮肤缺损创面的效果。方法:该研究为实验研究。采用超速离心法提取hUCMSC-sEV，通过透射电子显微镜观察其形貌，采用蛋白质印迹法检测CD9、CD63、肿瘤易感基因101（TSG101）及钙联蛋白的表达。将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及第3、4代人表皮角质形成细胞（HEK）、人真皮成纤维细胞（HDF）均分为常规培养的空白对照组和在细胞培养液中加入hUCMSC-sEV培养的hUCMSC-sEV组，行细胞划痕试验并计算划痕后 6、12、24 h 的细胞迁移率，行细胞Transwell试验并计算培养12 h细胞迁移数量，行5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷、Hoechst染色检测培养24 h增殖细胞比例，样本数均为3。制备单纯GelMA水凝胶及负载hUCMSC-sEV的GelMA水凝胶（以下简称hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶），通过扫描电子显微镜观察2种水凝胶微观形貌，通过激光扫描共聚焦显微镜观察hUCMSC-sEV的分布情况，采用蛋白质比色定量法测定并计算hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶在磷酸盐缓冲液（PBS）中浸泡0（即刻）、2、4、6、8、10、12 d时hUCMSC-sEV累积释放率（样本数为3）。将24只6周龄雄性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为PBS组、单纯hUCMSC-sEV组、单纯GelMA水凝胶组和hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组（每组6只），于小鼠背部制备全层皮肤缺损创面后分别行PBS注射、hUCMSC-sEV悬液注射、单纯GelMA水凝胶覆盖、hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶覆盖。于伤后0（即刻）、4、8、12 d观察创面愈合情况并统计伤后4、8、12 d创面愈合率，于伤后12 d取创面组织行苏木精-伊红染色后观察创面新生组织结构，样本数均为6。结果:提取的hUCMSC-sEV呈杯状结构，表达CD9、CD63和TSG101，几乎不表达钙联蛋白。划痕后6、12、24 h，hUCMSC-sEV组HEK（ t值分别为25.94、20.98、20.04）、HDF（ t值分别为3.18、5.68、4.28）、HUVEC（ t值分别为4.32、19.33、4.00）的迁移率均明显高于空白对照组（ P<0.05）。培养12 h，hUCMSC-sEV组HEK、HDF及HUVEC迁移数量分别为（550 ±23）、（235 ±9）、（856 ±35）个，均明显多于空白对照组的（188 ±14）、（97 ±6）、（370 ±32）个（ t值分别为22.95、23.13、17.84， P<0.05）。培养24 h，hUCMSC-sEV组HEK、HDF及HUVEC增殖细胞比例均明显高于空白对照组（ t值分别为22.00、13.82、32.32， P<0.05）。单纯GelMA水凝胶内部呈疏松多孔的海绵状结构且其中未见hUCMSC-sEV，hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶具有相同海绵状结构且其中可见hUCMSC-sEV呈团块状均匀分布。hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶浸泡2 d后hUCMSC-sEV累积释放率曲线趋于平缓，浸泡12 d时hUCMSC-sEV累积释放率为（59.2 ±1.8）%。伤后0~12 d，4组小鼠创面均不断缩小。伤后4、8、12 d，hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面愈合率均明显高于其余3组（ P<0.05），单纯GelMA水凝胶组、单纯hUCMSC-sEV组小鼠创面愈合率均明显高于PBS组（ P<0.05）；伤后8、12 d，单纯hUCMSC-sEV组小鼠创面愈合率均明显高于单纯GelMA水凝胶组（ P<0.05）。伤后12 d，hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面上皮化程度最佳，真皮胶原排列松散有序，炎症细胞数量最少；其余3组小鼠创面均可见真皮胶原排列致密且存在不同程度的炎症细胞浸润。 结论:hUCMSC-sEV能够促进皮肤创面愈合相关细胞HEK、HDF与HUVEC迁移与增殖，并可在GelMA水凝胶内缓慢释放。hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶作为创面敷料能够显著提高小鼠全层皮肤缺损创面愈合速度。

目的:探讨乳酸乳球菌温敏水凝胶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制。方法:(1)按照菌与培养基体积比为1∶100用M17GS液体培养基培养约5×10 8集落形成单位/mL乳酸乳球菌(浓度下同)，分别于培养0(即刻)、2、4、6、8、10、12 h用酶标仪观测其生长情况。另取该菌菌落同前处理并于相同时间点收集培养基分离细菌培养上清液，用台式pH计测定pH值，并用L-乳酸检测分析试剂盒测定培养0(即刻)、2、4、8、12 h的L-乳酸浓度(样本数为3)。(2)将泊洛沙姆温敏聚合物与M17GS液体培养基按照质量与体积比为0.2 g∶1 mL充分混匀，制备单纯温敏水凝胶。按照菌与水凝胶体积比1∶100在单纯温敏水凝胶中加入乳酸乳球菌，充分混匀后制备乳酸乳球菌温敏水凝胶，分别在4、37 ℃孵育以及成胶后再4 ℃孵育观察其形态；通过流变仪测定乳酸乳球菌温敏水凝胶在10～40 ℃的储能模量与损耗模量，同时观察成胶温度；将乳酸乳球菌温敏水凝胶冷冻干燥后，通过扫描电子显微镜观察其表面及其中乳酸乳球菌的形态结构。(3)将小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞用终质量浓度分别为100、10 ng/mL内毒素/脂多糖与γ干扰素培养24 h刺激M1型极化，将细胞分为空白对照组(不做其他处理)、乳酸乳球菌温敏水凝胶组和乳酸组。乳酸乳球菌温敏水凝胶组细胞加入1 mL乳酸乳球菌温敏水凝胶，乳酸组细胞加入终物质的量浓度为30 mmol/L乳酸，37 ℃培养24 h后，通过实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测M2型巨噬细胞标志物精氨酸酶1、CD206的mRNA表达量(样本数为3)，采用免疫荧光法检测精氨酸酶1和CD206的蛋白定位与表达。(4)取15只8～10周龄雌性BALB/c小鼠，通过链脲佐菌素联合高糖高脂饲料的方法诱导为糖尿病小鼠模型后，在每只小鼠背部制作直径6 mm全层皮肤缺损创面，采用随机数字表法将小鼠分为空白对照组(不做其他处理)、单纯温敏水凝胶组和乳酸乳球菌温敏水凝胶组，每组5只。水凝胶处理2组小鼠伤后即刻分别滴加200 μL相应水凝胶至创面，每天更换水凝胶。水凝胶处理2组小鼠处理0(即刻)、3、6、9、12 d后，观察创面愈合情况，测量创面面积；处理12 d后，取创面组织，行苏木精-伊红染色观察肉芽组织厚度，采用免疫荧光法观测CD206、M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)阳性细胞。空白对照组小鼠于前述相同时间点进行相应观测。(5)取9只8～10周龄雌性BALB/c小鼠同实验(4)方法诱导糖尿病小鼠模型后，采用随机数字表法分为正常皮肤组(不做其他处理)、单纯创面组、乳酸乳球菌温敏水凝胶组，每组3只。单纯创面组与乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠按照实验(4)方法制成全层皮肤缺损创面，前一组小鼠伤后不做其他处理，后一组小鼠伤后即刻滴加200 μL乳酸乳球菌温敏水凝胶至创面。水凝胶处理组小鼠处理1 d后，取创面组织，通过实时荧光定量RT-PCR法检测白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核因子κB mRNA表达量；眼球取血后，通过全自动血细胞分析仪检测外周血白细胞计数、淋巴细胞计数和单核细胞计数，通过L-乳酸检测分析试剂盒测定血清L-乳酸浓度。于前述相同时间点，取正常皮肤组小鼠相应部位正常皮肤组织、单纯创面组小鼠创面组织及2组小鼠血液进行相应检测。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、Tukey和Dunnett检验。 结果:(1)乳酸乳球菌于培养约6 h生长达到平台期。乳酸乳球菌培养上清液中，pH值逐渐降低，至培养8 h下降至最低值4.9左右；L-乳酸浓度逐渐升高，至培养8 h达到最高值约70 mmol/L。(2)乳酸乳球菌温敏水凝胶在4 ℃为液体溶胶态，在37 ℃为固体凝胶态，成胶后于4 ℃孵育后再次变为液体溶胶态；成胶温度约为25 ℃，成胶后储能模量约为3 000 Pa、损耗模量约为1 000 Pa。扫描电子显微镜下可见，乳酸乳球菌温敏水凝胶为疏松三维多孔结构，乳酸乳球菌为椭球形并被包裹在水凝胶内部。(3)培养24 h，与空白对照组比较，乳酸乳球菌温敏水凝胶组、乳酸组巨噬细胞中精氨酸酶1表达量显著升高( q＝11.620、15.250， P<0.01)、CD206 mRNA表达量显著升高( q＝16.770、19.030， P<0.01)，定位于细胞膜的CD206蛋白和定位于细胞质的精氨酸酶1蛋白表达明显升高；乳酸组巨噬细胞中精氨酸酶1、CD206 mRNA表达量与乳酸乳球菌温敏水凝胶组相近( q＝3.629、2.259， P>0.05)。(4)处理3～12 d后，与空白对照组和单纯温敏水凝胶组比较，乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠创面愈合速度更快，创面面积明显缩小，创缘炎症减轻。乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠处理3、6、9、12 d后创面面积[(25.8±5.9)、(21.2±4.6)、(16.0±2.4)、(8.4±2.4)mm 2]较空白对照组[(31.8±5.3)、(28.0±3.4)、(22.6±3.7)、(17.0±1.0)mm 2]显著缩小( q＝3.506、3.973、3.856、5.025， P<0.05或 P<0.01)，处理3、6 d后创面面积较单纯温敏水凝胶组显著缩小( q＝3.739、3.739， P<0.05)。处理12 d后，与空白对照组和单纯温敏水凝胶组比较，乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠创面肉芽组织更厚，创面组织中iNOS阳性细胞明显减少且CD206阳性细胞明显增多。(5)处理1 d后，单纯创面组小鼠创面组织中IL-1β、TNF-α和核因子κB mRNA表达量显著高于正常皮肤组小鼠正常皮肤组织( q＝9.253、4.819、6.020， P<0.01)，与乳酸乳球菌温敏水凝胶组相近( q＝2.850、2.735、2.556， P>0.05)；单纯创面组小鼠外周血白细胞计数、淋巴细胞计数与单核细胞计数显著高于正常皮肤组( q＝3.523、5.373、5.279， P<0.05或 P<0.01)，与乳酸乳球菌温敏水凝胶组相近( q＝0.621、1.240、1.293， P>0.05)；3组小鼠血清L-乳酸浓度均保持在正常范围内且组间总体比较差异无统计学意义( F＝4.095， P>0.05)。 结论:乳酸乳球菌温敏水凝胶在糖尿病全层皮肤缺损小鼠创面局部使用安全，能够通过原位生产投递乳酸，促进巨噬细胞从M1型向M2型极化，重塑创面愈合微环境，促进创面的高效愈合。

目的:探究新型自组装多肽水凝胶RATEA16支架对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）增殖及其载血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促进血管形成的作用。方法:制备RATEA16水凝胶，检测其可注射性、微观结构、降解性能及生物相容性等特性；与HUVEC体外三维培养，检测细胞形态及增殖情况；将HUVEC细胞与装载VEGF的RATEA16支架体外三维共培养，倒置显微镜下观察小管形成并通过实时荧光定量PCR检测VEGF-A、血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和血小板内皮细胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）基因的表达，评估载VEGF支架体系对HUVEC分化的影响，并与HUVEC单独培养的阴性对照组进行比较。结果:RATEA16溶液在调节pH值达中性后5 min完成溶胶-凝胶转变；该凝胶可从注射器中轻松推出，具备可注射性；扫描电子显微镜下呈多孔及相互连接的内部结构，支架孔隙率为（67.3±9.4）%；在体外降解4周时剩余质量百分比仍为（82.354±0.006）%；HUVEC在RATEA16水凝胶浸提液中培养24 h后生长良好，与对照组相比HUVEC细胞活力差异无统计学意义（ P>0.05）；HUVEC在该水凝胶中三维培养时呈球形，且在14 d内呈持续增殖活力；装载VEGF的RATEA16支架与HUVEC体外三维培养可观察到血管样结构形成，VEGF-A和MMP-9表达是阴性对照组的1.5~2.0倍，vWF表达是阴性对照组的10倍左右，PECAM-1表达是阴性对照组的55倍左右，与阴性对照组相比差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:RATEA16水凝胶具有简便的凝胶化过程、良好的生物相容性、较慢的降解速率及可注射性；HUVEC可在RATEA16支架中生长和增殖；载VEGF的RATEA16支架体系可促进HUVEC在体外成血管分化。