目的:对四川省一例由野生动物(猪獾)咬伤发病的疑似狂犬病病例的唾液标本进行狂犬病病毒的全基因组序列测定，从分子水平对病毒进行遗传变异特征分析，了解四川省野生动物狂犬病病毒的流行和变异情况。方法:从疑似狂犬病病例的唾液标本中提取总病毒RNA，采用PCR的方法以特异性引物进行狂犬病病毒序列扩增，将获得的基因片段进行测序，并运用生物学软件将所得序列进行拼接从而得到狂犬病病毒株的全基因组序列。对全基因组进行遗传变异特征分析。结果:经测序获得1株猪獾源狂犬病病毒(以下简称SCR23-052)全基因组核苷酸序列，经NCBI在线BLAST及与多个参考序列比对表明，SCR23-052全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病毒属特征；分别与宁夏毒株(J)、重庆毒株(CQ92、02050CHI)之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高，SCR23-052基因组序列差异性在氨基酸水平明显低于核苷酸水平，说明蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变。种系发生分析显示SCR23-052属于基因V型，其糖蛋白主要抗原位点未见明显突变，在线网址预测糖蛋白在第56和338位发生了氨基酸糖基化，SCR23-052与参考疫苗株CTN181的信号肽序列相比氨基酸差异最少。本研究病毒在核蛋白主要抗原位点与所有参考疫苗株均发生了相同的突变(332位A→T)，在B细胞表位仅与参考疫苗株CTN181相比发生了379位L→V的突变，SCR23-052与基因Ⅴ型的参考毒株在核蛋白研究位点均一致。结论:获得了1株野生动物猪獾源基因V型狂犬病病毒株全基因组序列，不同于四川以往报道流行的犬源狂犬病病毒基因I型毒株。SCR23-052与各参考株基因组序列相比有不同程度差异，但主要毒力特征未改变。

目的:利用狂犬病毒糖蛋白（RVG）修饰的外泌体与超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）构建神经靶向分子探针RVG-Exo-SPION，研究其表征及体外磁共振成像（MRI）效果。方法:构建RVG-Lamp2b质粒并转染HEK293细胞，提取膜表达RVG的外泌体，电穿孔与SPION合成磁性分子探针RVG-Exo-SPION。采用免疫印迹、透射电镜分析（TEM）、纳米粒径追踪分析（NTA）及体外毒性分析（CCK-8法）方法分别对分子探针外泌体膜蛋白表达、形状、尺寸和生物相容性进行分析和鉴定，并通过激光共聚焦成像、普鲁士蓝染色和MRI联合评估Neuro-2A细胞对分子探针的摄取能力。结果:双酶切法证明目的基因重组至pcDNA3.1质粒中，免疫印迹显示重组质粒被有效转染至HEK293细胞，外泌体标记蛋白CD9和CD63呈高表达。TEM显示修饰和电穿孔后的外泌体保持其正常的形状、尺寸和膜结构，外泌体电穿孔后能见到SPION的存在。NTA显示工程化的外泌体粒径分布窄，粒径分布峰值为140 nm。Neuro-2A细胞与1~100 mg/L不同浓度梯度的RVG-Exo-SPION共同孵育时，细胞的活力差异无统计学意义（均 P>0.05）。激光共聚焦显微成像分析显示外泌体能高效地进入细胞，线形图显示实验组荧光强度更高；普鲁士蓝染色验证了RVG-Exo-SPION对Neuro-2A细胞的靶向能力，靶向组的阳性细胞标记率明显高于对照组[（75.8±5.6）%比（19.1±2.5）%）， P<0.05]；体外MRI显示灰阶值在不同铁浓度（5、10、25、50、100 mg/L）之间有明显区别，且在Fe≥25 mg/L的浓度下易于识别。 结论:基于RVG修饰外泌体构建的磁性分子探针RVG-Exo-SPION在体外实验中具有较好的稳定性和神经靶向性，为进一步用于体内研究提供了可行性。

目的:评价从噬菌体库筛选获得的1株抗狂犬病病毒单克隆抗体的基本特征。方法:从抗狂犬病病毒噬菌体库中筛选获得1个阳性克隆，扩增获得其抗体轻重链可变区，构建全分子抗体的表达质粒后在HEK293 EBNA1细胞中瞬时表达，亲和纯化后对该抗体进行体外抗狂犬病病毒中和活性、中和指数、逃逸株测序、差示扫描荧光法热稳定性分析，并与数据库中街毒株糖蛋白比对关键氨基酸位点。结果:该抗体体外抗狂犬病病毒中和活性为691IU/mg；该抗体对狂犬病病毒CVS-11和CTN株的中和指数分别为8.52和7.05；CVS-11逃逸株糖蛋白测序分析表明，该抗体针对的关键氨基酸主要为N37 K、N194 K和K205 N。与1 338株狂犬病病毒街毒株糖蛋白基因比对表明，37、194和205位上仅有1个街毒株在194位上与突变逃逸株氨基酸类型相同。该抗体Tm值为70.58±0.31 ℃。结论:获得1株高中和指数的全分子人源抗狂犬病病毒中和抗体，该抗体具有较好的热稳定性。

目的 应用复合凝胶Capto Core700作为纯化介质去除狂犬病疫苗中的Veto细胞宿主蛋白和宿主细胞DNA等杂质.方法 将Vero细胞接种至微载体,在celligen plus生物反应器中培养,按MOI=0.002接种狂犬病病毒,连续制备10批狂犬病疫苗原液.经过滤及浓缩后加入β-丙内酯,于2～8℃灭活24 h,获得病毒灭活液.上样至装载复合凝胶Capto Core700的纯化柱进行层析纯化,并按《中国药典》三部(2015版)的方法检测宿主细胞蛋白去除率、宿主细胞DNA去除率、狂犬病病毒糖蛋白回收率及总蛋白去除率.同时与传统Sepharose系列凝胶纯化方法进行比较.结果 10批疫苗纯化液的宿主细胞蛋白去除率为58.3％～63.2％,宿主细胞DNA去除率均＞90％,糖蛋白回收率范围为52.3％ ～ 74.5％,蛋白去除率范围为7.22％ ～ 11.76％.与传统Sepharose系列凝胶纯化方法比较,差异较小,且Capto Core700的上样量为3倍柱体积,高于Sepharose凝胶(15％).结论 Capto Core700凝胶可有效去除狂犬病疫苗中的杂质,缩短了纯化工艺时间.

目的 了解云南省2012-2015年35株狂犬病病毒(RABV)糖蛋白(G)基因的进化特征及流行病学特点.方法在云南省狂犬病流行区采集可疑犬脑组织以及狂犬病患者脑组织和唾液标本,用直接免疫荧光法进行病毒抗原检测,阳性标本提取病毒核酸,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增RABV的G基因序列,用MEGA 5.0软件邻接法(NJ)进行系统进化树分析.结果 经RT-PCR和序列测定获得2012-2015年云南省35株RABV的G基因序列,并与2006-2011年获得的云南省11株RABV及邻省和东南亚地区的15株RABV的G基因序列进行系统进化分析.结果 表明,云南省46株RABV中,除2006年的Tc06株属于China-Ⅵ进化群外,其他45株均属于China-Ⅰ进化群.云南省China-Ⅰ进化群流行株在2006-2015年间每年均有分布,其中,2006-2011年10株,2012-2015年35株,分布于云南省10个州(市)并与来自四川、贵州和湖南省的China-Ⅰ进化群病毒株的进化关系最为接近.China-Ⅵ(Tc06)则与缅甸、老挝和越南的东南亚进化群病毒株亲缘关系最近.结论2012-2015年,RABV China-Ⅰ进化群在云南省狂犬病流行区广泛分布,属云南省主要进化群并具较强的传播速率,期间云南省未再发现China-Ⅱ、China-Ⅲ和China-Ⅵ等进化群病毒株的流行.

目的 阐明云南省西双版纳傣族自治州(西双版纳州)2008-2017年狂犬病流行病学特点和狂犬病病毒流行株遗传进化特征.方法 收集狂犬病病例资料,采集狂犬和可疑犬脑组织以及狂犬病患者唾液、脑脊液和尸检脑组织标本,用反转录聚合酶链式反应扩增狂犬病病毒核蛋白和糖蛋白基因核苷酸序列,用相关生物学软件进行同源性和进化分析.结果 2008-2017年西双版纳州所辖3个县的28个乡镇(办事处、农场)共发生狂犬病62例,其中景洪市、勐海县和勐腊县分别为37例、15例和10例.其中48例被家犬咬伤(77.42％),11例被流浪犬咬伤(17.74％).这10年间每年都有病例发生,季节性发病不明显;年龄以30 ～ 59岁为主,最小1岁,最大91岁;男女性别比为1.70:1,以农民为主.获得9株狂犬病病毒的核蛋白基因核苷酸序列(景洪7株、勐海1株和勐腊1株),进化和同源性分析表明,5株为China-Ⅰ进化群、3株为China-Ⅱ和1株为China-Ⅵ.还获得5株狂犬病病毒的糖蛋白基因序列(景洪3株、勐海1株和勐腊1株),均为China-Ⅰ进化群,与这5株的核蛋白基因分析结果一致.西双版纳China-Ⅰ和China-Ⅱ狂犬病病毒均与近几年相邻普洱市以及四川、贵州和广西相应进化群流行株具有较近的遗传进化关系;China-Ⅵ与滇西南的China-Ⅵ以及邻国缅甸、老挝和越南流行株具有较高同源性和亲缘性.结论 西双版纳狂犬病主要流行于农村地区,家养犬为主要传染源.当地存在狂犬病病毒的China-Ⅰ、China-Ⅱ和China-Ⅵ进化群,以China-Ⅰ为主;China-Ⅰ和China-Ⅱ的传播来源为相邻地区,China-Ⅵ的传播来源为缅甸和老挝.

目的 调查分析1例狂犬病患儿的临床特征、疫情资料和病原学特征,为狂犬病防控提供数据支持.方法 收集患儿临床资料,开展流行病学调查;采用逆转录-聚合酶链反应和荧光定定量逆转录-聚合酶链反应检测狂犬病病毒核酸.结果 患儿发病全程无典型狂犬病临床表现,家属否认患儿近期有动物致伤史.患儿临床以发热、呕吐、腹泻为早期症状,后期陷入昏迷直至死亡.患儿发病前1个月有鼻部外伤史,同期家中有1只犬病死.患儿唾液样本经荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测狂犬病病毒核酸结果为阳性,经逆转录-聚合酶链反应检测获得狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白基因预期扩增片段,糖蛋白基因序列比对分析显示致病病毒株与河南省狂犬病病毒流行株核苷酸同源性为96.5％ ～98.8％,氨基酸同源性为96.5％～99.2％.结论 患儿经实验室诊断确诊为狂犬病病例,致病狂犬病病毒为河南省固有流行株.鼻部外伤史、病死犬可能与患儿感染存在某种关联.

目的 了解四川省2011—2017年间狂犬病病毒(rabies virus,RABV)株的分子特征以及流行株与疫苗株在核酸、氨基酸和蛋白修饰水平上的差异.方法 对采集于2011—2017年间的23份RABV抗原阳性犬脑组织标本,通过RT-PCR以特异性引物扩增病毒核蛋白(nucleoprotein,N)基因和糖蛋白(glycoprotein,G)基因并测序,通过生物信息学软件分别对N基因和G基因进行基因特征分析.结果 对23株RABV(简称四川株)N、G基因测序获得的全序列遗传进化关系分析表明,四川株均为rabies virus种,可分为3个进化分支且具有明显的地域特征,部分四川株与我国东部和北方流行毒株共循环.四川株间N基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.4％～100％和99.6％～100％,与参考株N基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.1％～99.8％和81.6％～100％.四川株与疫苗株相比在抗原位点、细胞表位以及信号肽序列上有一定差异,但主要抗原性、组织嗜性和毒力没有改变.结论 四川株间无明显差异,均为rabies virus种.四川株与疫苗株病毒糖蛋白的氨基酸序列存在不同程度的差异,但毒力未发生改变.

狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)是唯一暴露于病毒颗粒表面的抗原,能够诱导宿主产生中和抗体,也是唯一存在于所有新型狂犬病疫苗中的病毒成分.本文综述了国内外学者利用原核系统,以及包括酵母系统、植物系统、昆虫细胞系统在内的真核系统和哺乳动物细胞系统、病毒载体系统来表达具有免疫原性的重组狂犬病病毒糖蛋白(rRVGP),并对其与天然RVGP在结构和激发机体免疫反应方面的相似性进行的相关研究,为狂犬病基因工程新型疫苗提供研究思路.