目的:建立诺如病毒原型株诺瓦克病毒（Norwalk virus，NV）P蛋白细菌细胞表面展示体系，并对其进行功能评价。方法:构建pET28a-inaQn-TB-P(GI.1)重组质粒，并在大肠杆菌中进行诱导表达，建立升级版假NV。以猪胃粘膜提取物中已知NV受体组织血型抗原（human histo-blood group antigens，HBGAs）为对象，验证假病毒特异性识别、捕获HBGAs的能力；以生菜叶中类HBGAs为对象，验证升级版假NV捕获生菜叶中NV配体的特性，并对所捕获的配体进行初步分析。结果:获得可高效捕获NV受体/配体的假病毒体系，该体系可特异性识别并捕获猪胃粘膜提取物中A型HBGA和生菜中类HBGAs。另外，所捕获生菜中类HBGAs可以分别被A、H和Lewis a型HBGA单克隆抗体识别，且以H型HBGA抗原位点暴露最多。结论:本研究成功建立了NV的P蛋白细菌细胞表面展示体系，可以识别并捕获HBGAs及其类似物，为解析NV与配体互作机制提供技术平台。

目的:通过构建含有不同大小乘客结构域的Ag43表面展示载体，观察其将外源蛋白HPV16L1展示在细菌细胞表面的效率。方法:(1)利用基因工程手段将不同长度的Ag43基因序列连接到pET22b载体，获得4种Ag43表面展示载体：Ag43/138、Ag43/551、Ag43/552、Ag43/700；(2)克隆HPV16L1编码基因序列，利用基因工程手段将其分别连接到上述4种Ag43表面展示载体，获得4种重组蛋白表达载体；(3)HPV16L1-Ag43融合蛋白表达及SDS-PAGE分析；(4)利用胰蛋白酶消化验证HPV16L1蛋白在大肠埃希菌的表面展示。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增获得的Ag43和HPV16L1条带与预期大小一致，表面展示载体和重组蛋白表达载体的基因序列均通过基因测序验证无误。经IPTG诱导后，构建的4种Ag43表面展示载体均能表达HPV16L1蛋白。胰蛋白酶消化后，4种重组蛋白条带均减弱，且Ag43/700-HPV16L1条带减弱最明显。结论:成功构建了基于自转运蛋白Ag43的细菌表面展示载体，HPV16L1蛋白可通过构建的4种Ag43表面展示载体表达并展示在大肠埃希菌表面，且仅保留α-螺旋和β-桶状结构域部分的Ag43表达载体即Ag43/700的表面展示效果最优。

目的 在骨内植入物表面构建10个双层蒙脱土/透明质酸-替考兰宁[(MMT/HA-TEC)10]多层膜抗菌涂层,探索其酶响应性抗菌效果.方法 通过原子粒显微镜观察多层膜抗菌涂层表面形貌,光谱椭圆偏振法测试其厚度和全自动接触角测量仪测量其表面接触角.采用抑菌环实验探索抗菌涂层的抗生素在接触酶和细菌的情况下的缓释规律.电导率、细胞外蛋白水平检测和抑菌效果测试,宏观展示抗菌涂层的抗菌效果;采用高压蒸汽灭菌法测试抗菌涂层的抑菌稳定性.采用细菌活死染色实验探索抗菌涂层表面清除死亡细菌的能力.采用CCK-8实验法分析抗菌涂层的生物相容性.动物实验检测抗菌涂层的体内抗菌效果.结果 (MMT/HA-TEC)10多层膜抗菌涂层在组装过程中,厚度呈线性增长,从(8.16±1.36)nm增长至(113.28±4.44)nm.接触角也明显变大,从组装前的27.1°变为组装后的65.0°.(MMT/HA-TEC)10多层膜抗菌涂层在与金黄色葡萄球菌和透明质酸酶(HAS)溶液孵育后逐渐降解,并显示出良好的浓度依赖性降解特性.抗菌涂层是通过改变细菌细胞膜的通透性来实现高效的杀菌效果,在经过高压蒸汽灭菌处理后其杀菌率依然＞99％,并且在一定程度上可以清除材料表面的死亡细菌.CCK-8实验显示(MMT/HA-TEC)10多层膜抗菌涂层具有良好的生物相容性.动物实验表明(MMT/HA-TEC)10多层膜抗菌涂层在体内依然具有良好的抗菌作用.结论 (MMT/HA-TEC)10多层膜抗菌涂层具有高效的酶响应性抗菌功能.

目的:构建产单核细胞李斯特菌胞外蛋白p60的N端肽聚糖结合基序(p60-N)表达载体,实现其在枯草芽孢杆菌中的分泌表达.方法:将目标基因克隆到表达载体pHT43中获得重组载体pHT43-p60-N,转化枯草芽孢杆菌WB800N获得重组工程菌株WB800N/pHT43-p60-N,在此基础上考察IPTG浓度、培养基、表达时间和温度等条件对目标蛋白表达的影响.结果:p60-N蛋白可在枯草芽孢杆菌中分泌表达,与鼠李糖乳杆菌形成的革兰阳性增强基(GEM)颗粒特异性结合,具有与天然蛋白类似的生物学活性.用GB培养基,在37℃下,加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导12～20 h,表达量提高到28 mg/L.结论:实现了p60蛋白N端基序在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,为进一步研究以该蛋白为基础的细菌样颗粒疫苗奠定了基础.

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)作为肿瘤标志物,在临床肿瘤诊断及肿瘤靶向治疗等方面具有重要应用价值.癌胚抗原单链抗体(CEA-specific single chain antibody fragments,CEA-scFv)能够特异性结合癌胚抗原.本研究将癌胚抗原单链抗体展示于大肠杆菌细胞表面,分析其作为癌胚抗原检测平台和细菌靶向载体的可行性.首先将CEA-scFv基因克隆到表面展示载体pBAD-OmpA-mCherry中,经酶切和测序证实,成功构建了重组质粒pBAD-OmpA-mCherry-CEA.重组菌经阿拉伯糖诱导后可检测到红色荧光,荧光强度在胰酶的作用下降低,全菌ELISA检测呈阳性反应,提示融合蛋白和目的蛋白质在重组菌表面展示成功.由Western印迹分析可知,融合蛋白质的相对分子质量约为85 kD,符合预期设计.进一步的研究提示,重组菌在大肠杆菌表面展示的癌胚抗原单链抗体具有生物活性,能够有效结合A549细胞裂解液的癌胚抗原.在细菌侵染细胞实验中,与对照组相比,重组菌孵育A549细胞后细胞内可明显观察到点状红色荧光,证明重组菌能够靶向侵入癌胚抗原阳性肿瘤细胞.本研究为癌胚抗原相关的快速诊断和基于细菌载体的肿瘤靶向治疗奠定了实验基础.

细菌表面展示是将靶标蛋白质表达于细菌表面以更好地实现其功能的一种技术,它在重组细菌疫苗、生物燃料电池、全细胞催化剂和生物修复等多个领域均有广泛的应用.随着相关技术的发展,表面展示系统的各种性能被不断地改良,同时新的表面展示系统也陆续被开发和应用,使该技术得到持续的丰富和发展.本文重点关注近年研究得较多的细菌表面展示系统,主要对各类细菌表面展示系统的开发、改造和修饰,以及该技术在生物修复和生物传感器方面的应用作一综述.

目的:利用酿酒酵母表面展示技术筛选幽门螺杆菌候选疫苗,并分析其免疫原性.方法:以幽门螺杆菌的空泡型细胞毒素A(vacA)基因作为研究对象,构建重组S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA,通过Western blot、免疫荧光标记和流式细胞仪对S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA进行体外表达分析.以PBS和S.cerevisiae EBY100/pYD1为对照组,S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA为实验组,口服免疫SPF级BALB/c小鼠.通过ELISA分析检测口服免疫后小鼠抗VacA特异性IgG及分泌型IgA效价.结果:VacA抗原蛋白被成功地展示在S.cerevisiae EBY100表面.小鼠经口服免疫S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA后可诱导产生较高的VacA特异性抗体.结论:表面展示型酿酒酵母可以作为幽门螺杆菌候选疫苗的递送载体,与此同时,这也为开发其他细菌或病毒疫苗提供新思路.

人源诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是重要的肠胃炎病毒之一,造成了全球巨额经济负担,故其防控成为研究热点.探究不同形式的免疫原对机体体液和粘膜免疫的激发效果,成为HuNoVs疫苗研发的一个突破口.本研究利用前期以细菌细胞表面展示体系构建的假HuNoVs(GⅡ.4)和纯化的P(GⅡ.4)蛋白为对象,乳化后每隔两周分别进行Balb/C小鼠皮下多点和口服免疫,并以间接酶联免疫吸附试验测定血清中抗体的消长规律.同时,以磷酸盐缓冲液作为对照.抗体效价测定结果显示:皮下免疫组的假HuNoVs(GⅡ.4)可以有效激发小鼠体液免疫,其效价稍低于以P(GⅡ.4)蛋白作为抗原免疫获得的抗体.经过5次免疫后,血清中IgG抗体效价基本趋于稳定.但是,假HuNoVs(GⅡ.4)和P(GⅡ.4)蛋白的口服免疫组血清中均未测到IgA和IgG抗体.因此,细菌细胞表面展示体系假HuNoVs(GⅡ.4)可以作为HuNoVs疫苗候选抗原的提呈体系,为该病毒的疫苗研发提供借鉴.

革兰氏阴性菌Ⅴ型分泌系统是细菌病原蛋白分泌的主要途径之一,可分为Ⅴa-Ⅴe5个亚型,其中Ⅴa型(即经典的单体自转运蛋白)是细菌毒力和黏附因子向细胞外分泌的重要工具,其在内膜Sec易位子和外膜BAM蛋白复合体的协助下,通过2个连续的跨膜步骤介导蛋白质穿过阴性菌的内外膜.据信Va型是目前已知蛋白质跨膜转运时最简单的分泌途径,故该蛋白质分泌系统作为一种生物工程手段被认为是进行外源蛋白细菌细胞表面展示的理想系统.本文概括了目前已知的自转运蛋白的种类、结构域组成及其可能的分泌机理,总结基于自转运蛋白构建细菌细胞表面展示系统的生物工程应用,特别是其在疫苗研发领域的最新研究进展,并探讨了其在病原体检测方面的潜在应用,以期深入拓展该分泌系统在生物工程方面的应用.

拟除虫菊酯类农药由于其高疏水性和高分子质量,难以被微生物吸附、摄取和降解,如何提高此类底物的生物可及性是环境生物修复的关键之一.利用细胞表面展示技术将拟除虫菊酯降解酶展示到大肠杆菌细胞表面,构建新型全细胞催化剂,克服拟除虫菊酯类农药的吸附-摄取限制.将丁香假单胞菌冰核蛋白InaK的N-末端作为锚定基序与来自铜绿假单胞菌GF31的拟除虫菊酯降解酶基因融合,转化大肠杆菌Rosetta-gami,构建全细胞催化剂.结果表明在0.05 mmol/L的IPTG条件下诱导培养12 h后,该全细胞催化剂的氨基肽酶活性达到0.25 U/OD600/mL,对高效氯氰菊酯农药底物的降解速率达到35.9 μmol L-1 d-1,且对5种常用拟除虫菊酯类农药均具有降解能力.通过细胞的分级分离和免疫荧光分析确定了功能蛋白在细胞膜上的正确位置.该全细胞催化剂经过10次重复反应,残余活性仍能保持在70％以上,具有较好的稳定性.本研究实现了拟除虫菊酯降解酶在大肠杆菌细胞表面上的功能性展示,为高疏水性有机农药的环境修复提供了一种方法.