目的:观察转基因番茄防龋疫苗经灌胃免疫SD大鼠后的防龋效果,初步探索其免疫机制.方法:采用SD大鼠建立实验性龋齿模型,培育并鉴定转基因防龋番茄,将表达目的蛋白的转基因番茄防龋疫苗分次灌胃免疫SD大鼠,Elisa法检测SD大鼠唾液及血液样品中特异性抗PAcA的SIgA和IgG含量,取上下颌骨进行Keyes龋齿计分,取脾脏进行RNA-seq测序分析.采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析.结果:转基因番茄防龋疫苗中目的蛋白浓度为36.28 μg/mL,免疫SD大鼠后,D组(8 mL/kg)在第6周产生的特异性SIgA和IgG抗体水平最高,且与其他组存在显著差异(P＜0.05),龋齿计分也较其他组差异显著(P＜0.05).提取该组SD大鼠脾脏mRNA经RNA-seq测序,得到40个mRNA表达差异显著基因(P-adjust＜0.05 & |Fold Change|≥1.5).26个基因显著上调,包括IGFBP6、COL15A1等,GO富集到体液免疫反应、B细胞活化、免疫球蛋白受体结合等;KEGG富集到56条信号通路,包括PI3K-AKT、NF-κB等信号通路,且F＜0.001.14个基因显著下调,但下调基因GO和KEGG富集分析无统计学意义(F＞0.1).结论:转基因番茄防龋疫苗可能通过上调SD大鼠IGFBP6基因,介导PI3K-AKT信号通路的激活而减少龋齿发生.

背景:转基因植物防龋疫苗因其生产工艺简单、价格低廉、有较好的免疫原性及安全有效等优点逐渐展现出其独特的优势,成为近年研究的热点.目的:用含PAcA/CTB的转基因番茄以灌胃的方式免疫SD大鼠,观察其免疫反应性及免疫原性.方法:将雄性SD大鼠随机分成3组,建立动物龋齿模型1周后,阳性对照组大鼠灌胃灭活变异链球菌疫苗;实验组大鼠灌胃表达PAcA/CTB转基因番茄疫苗;阴性对照组大鼠灌胃普通番茄汁,每周灌胃免疫1次,连续4周.于免疫前、免疫后1,2,3,4周采集大鼠的血液及唾液样本,用ELISA法检测血清及唾液中抗变异链球菌PAcA的IgG、sIgA抗体水平;鼠龄57 d时片切大鼠上、下颌磨牙进行龋齿计分.实验方案经遵义医学院动物实验伦理委员会批准.结果与结论:①阳性对照组、实验组分别与阴性对照组比较,第1,2,3,4周小鼠唾液中sIgA型抗PAcA抗体水平均显著升高(P＜0.01);②与阴性对照组比较,阳性对照组免疫后第1-4周,实验组免疫后第2-4周小鼠血液中IgG型抗PAcA抗体水平显著升高(P＜0.05,P＜0.01);③阳性对照组牙齿的损坏程度最小,少数达牙本质浅层,龋齿数量最少;其次是实验组;阴性对照组损坏最为严重,龋损数量最多;④结果说明,表达嵌合蛋白PAcA/CTB的转基因番茄疫苗能够通过胃肠道吸收的方式免疫大鼠,具有一定的免疫原性及免疫反应性,并且减少龋齿的发生.

背景:转基因植物可食性疫苗是以植物作为载体,将外源性基因整合到植物基因组当中,进一步激活动物或人体免疫系统以获得特异性免疫能力.但外源性基因的持续低表达量一直无法达到满意的免疫效果.目的:用分子生物学技术检测转基因番茄植株中pacA-ctxB融合基因表达及目的蛋白的表达量,为进一步观察可食用防龋疫苗的防龋效果提供研究基础.方法:①提取转基因番茄叶片总DNA,PCR检测外源性融合基因pacA-ctxB,实验分组3组:阳性对照组为质粒p2355-EPC10;空白对照组为普通番茄1株(红抗219);转基因组为转基因番茄9株;②BCA法检测转基因番茄果肉中总蛋白的水平;Western blot证实转基因番茄果实中PAcA/CTB目的蛋白的表达,目的蛋白检测分组2组:转基因组为表达外源性嵌合基因的转基因番茄5株(PCR检测阳性);空白对照组为普通番茄1株;酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测转基因番茄果实中PAcA/CTB目的蛋白浓度.结果 与结论:①PCR扩增结果可见9株转基因番茄中有5株出现约1.7 kb特异性扩增条带,占总检测植株的55％;②转基因番茄总蛋白为3.15 g/L;Western blot可见PCR检测为阳性的转基因番茄蛋白提取样本在分子质量约为58 kD处均出现了高密度条带,非转基因番茄蛋白样本未见特异条带;ELISA测得目的蛋白表达量约4.12 mg/L,占番茄可溶性总蛋白的0.13％;③结果说明,外源性融合基因pacA-ctxB能够在番茄植株中表达及产生目的蛋白.