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染色体DNA琼脂糖包埋法辅助的ExoCET技术克隆放线菌天然产物生物合成基因簇
编辑人员丨2023/8/5
[目的]本研究旨在通过将琼脂糖包埋染色体DNA的方法与ExoCET重组技术相结合,建立放线菌天然产物生物合成基因簇的捕获方法.然后将克隆基因簇导入通用底盘宿主中,实现目标生物合成基因簇的异源表达.[方法]首先,利用低熔点琼脂糖包埋技术制备菌株的染色体基因组总DNA,再用限制性内切酶消化含有染色体DNA的琼脂块,获得线性化的DNA样品;然后利用ExoCET重组技术,以p15A线性载体片段将目标基因簇线性片段进行捕获;再通过PCR-targeting的方法向目标质粒中引入所需的接合转移DNA元件.接着,将改造质粒通过接合转移导入到StreptomycescoelicolorM1252宿主中,获得不同的重组菌株.最后,对不同的菌株进行发酵并提取化合物,最后进行活性检测以及质谱检测.[结果]通过该方法,从菌株S.lincolnensis NRR2936中成功获得了林可霉素生物合成基因簇(lmb-BGC),从菌株Nonomuraea nitratireducens WYY166T中克隆得到了 2个核糖体肽类化合物的生物合成基因簇(nioblantin,niob-BGC和nitblantin,nitb-BGC),并实现了lmb-BGC在天蓝色链霉菌M1252中的成功表达.[结论]本研究通过将低熔点琼脂糖包埋技术与ExoCET重组技术进行合理整合,定向克隆得到了林可霉素以及2个新颖的羊毛硫肽类化合物的生物合成基因簇.然后,分别对重组质粒改造后,在天蓝色链霉菌M1252宿主中进行表达,分别获得重组菌株MJX01、MJX02和MJX04.最后,利用质谱以及活性测试的手段对发酵提取物进行了检测,确定了林可霉素生物合成基因簇在天蓝色链霉菌M1252中成功表达.本研究为通过基因簇克隆和异源表达发掘新化合物奠定了基础.
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编辑人员丨2023/8/5
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Nonomuraea candida HMC10T 中新结构套索肽 noncaromin生物合成基因簇的克隆及异源表达
编辑人员丨2023/8/5
[目的]本研究旨在通过定向克隆菌株Nonomuraea candida HMC10T中一个新的Ⅱ型套索肽类生物合成基因簇,通过在放线菌底盘宿主中的异源表达,获得新结构套索肽noncaromin,并完成其抑菌活性分析.[方法]通过antiSMASH软件分析菌株N.candidaHMC10T全基因组序列,确定新的 Ⅱ 型套索肽 noncaromin 的生物合成基因 簇(biosynthetic gene cluster of noncaromin,nonc-BGC).然后,利用 ExoCET 重组技术(exonuclease combined with RecET recombination)获得完整的nonc-BGC,得到重组质粒pJQK652,并通过λ-Red重组技术改造得到整合型质粒pJQK653.采用接合转移方法,将该质粒分别导入白色链霉菌、2株变铅青链霉菌、2株天蓝色链霉菌和红色糖多孢菌宿主中进行异源表达,再通过发酵和分离纯化获得目标套索肽noncaromin.最后,利用QTOF-ESI-MS2完成套索肽noncaromin的结构鉴定,并通过抗菌活性检测确定该化合物的生物活性.[结果]本研究利用ExoCET技术成功获得了完整的nonc-BGC,在6种放线菌宿主中成功异源表达,完成了 noncaromin的结构鉴定,确定了其具有微弱的抗枯草芽孢杆菌活性.[结论]本研究在克隆得到新结构套索肽nonc-BGC的基础上,实现了该基因簇在6个放线菌底盘宿主中的成功表达,获得了 1个具有微弱抑制枯草芽孢杆菌活性的新结构Ⅱ型套索肽noncaromin.本研究结果为发掘菌株N.candida HMC10T及其他放线菌中的新结构化合物提供了借鉴.
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编辑人员丨2023/8/5
