文章首先采用细胞表达抑制状态的代谢型谷氨酸受体 5(Metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)蛋白免疫野生双峰驼,构建纳米抗体文库,运用M13 噬菌体展示技术,筛选出与mGluR5具有特异性结合的纳米抗体;其次用细胞对mGluR5蛋白进行表达纯化,然后对野生单峰驼进行 7次免疫,对抽取骆驼的外淋巴细胞总RNA进行提取,经过反转录的方式转为cDNA,将用巢式PCR对VHH片段进行扩增并与pMECS噬菌粒载体进行连接,并电转化至TG1大肠杆菌中构建纳米抗体噬菌体展示文库;其三通过M13噬菌体展示技术对文库进行淘选,淘选出多个互补决定区 3 序列不同的纳米抗体;最后纯化出纯度较高的mGluR5 蛋白,构建出库容量为 5.47×108CFU/mL的噬菌体文库菌,经过两轮液相淘选,获得了12个互补决定区3 序列不同的纳米抗体.研究成功筛选出12 个与mGluR5特异性结合较高的纳米抗体,为mGluR5 的靶向药物研发和G蛋白偶联受体的信号通路研究奠定了基础.

目的 建立噬菌体展示羊型布鲁氏菌16M株表面蛋白文库,差减筛选具有良好特异性、亲和力及反应原性的蛋白,为确定新型诊断用抗原奠定基础.方法 利用噬菌粒载体pYW01构建重组羊型布鲁氏菌16M株基因文库,辅助噬菌体VCSM13感染基因文库进而构建噬菌体展示羊型布鲁氏菌16M蛋白文库.利用PEG纯化后,扩增蛋白文库.随机挑取单克隆,提取质粒,测序鉴定蛋白文库.通过差减筛选,选择具有良好特异性、亲和力及反应原性的表面蛋白,为确定诊断用抗原奠定基础.结果 通过DNA重组技术,构建羊型布鲁氏菌16M基因文库,库容量达到108 pfu/ mL,并且随机性良好.利用辅助噬菌体VCSM13包装基因文库,随机挑取蛋白文库中单克隆,提取质粒,经测序鉴定,成功构建噬菌体展示羊型布鲁氏菌16M株表面蛋白文库.利用免疫血清及感染血清对噬菌体展示蛋白文库进行差减淘选,筛选出6个噬菌体融合蛋白.经Western-blot分析6个噬菌体融合蛋白均具有较好的反应原性及特异性.结论 成功构建噬菌体展示布鲁氏菌蛋白文库,差减筛选出6个具有较好反应原性及特异性的融合蛋白,为后续新型血清学诊断制剂筛选奠定基础.

目的 建立检测B细胞成熟抗原(BCMA)的噬菌体展示单链抗体实时荧光定量免疫PCR(PDRT-IPCR)方法.方法 采用无缝克隆技术将抗体ANTI-BCMA片段连接入噬菌体M13KO7中,构建重组噬菌体质粒M13KO7-ANTI-BCMA,保存于E.coli DH5α感受态细胞中,通过PEG/NaCl溶液低温沉降后获得重组噬菌体M13KO7-ANTI-BCMA.采用Western Blotting法鉴定重组噬菌体M13KO7-ANTI-BCMA是否展示抗BCMA单链抗体.以不同浓度的BCMA包被96孔高吸附酶标板,加入重组噬菌体M13KO7-ANTI-BCMA,热裂解后,以裂解噬菌体的DNA作为扩增模板,进行实时荧光定量PCR,观察不同浓度BCMA的实时荧光定量PCR扩增曲线.运用OriginPro2021软件进行四参数Logistic拟合曲线,根据相关系数R2确定线性范围,计算最低检测限.以重组噬菌体M13KO7-ANTI-CD19和噬菌体M13KO7为对照,验证PDRT-IPCR方法检测BCMA的特异性.结果 抗BCMA单链抗体成功展示在重组噬菌体M13KO7-ANTI-BCMA表面.随着BCMA包被浓度的降低,对应扩增曲线的CT值逐渐变大,PDRT-IPCR检测BCMA的线性范围为0.1 ng/mL～1000 ng/mL,R2为0.9993,最低检测限为0.077 ng/mL.重组噬菌体M13KO7-ANTI-BCMA与BCMA的结合是特异性的.结论 本研究建立了检测BCMA的PDRT-IPCR方法,该检测方法具有检测限灵敏、线性范围宽、特异性高等特点.