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重组蛋白Rv2346c抑制巨噬细胞对结核分枝杆菌的免疫灭活效应
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨重组蛋白Rv2346c对卡介苗(BCG)感染鼠巨噬细胞(RAW264.7)后的免疫效应的影响及其机制.方法 通过DNA合成、基因扩增、载体构建、诱导表达、纯化等过程制备重组蛋白Rv2346c;利用Cell Counting Kit-8 (CCK8)方法检测RAW264.7增殖水平;采用菌落形成试验评估BCG生长情况;运用ELISA方法检测BCG和RAW264.7共培养上清中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6 (IL)-6的浓度;采取Western blot方法检测RAW264.7细胞中核转录因子κB (NF-κB) p65的表达水平.结果 DNA测序及Western blot检测证实成功制备重组蛋白Rv2346c;BCG可以抑制RAW264.7细胞增殖(P＜0.05),而RAW264.7细胞对BCG有灭活作用(P＜0.05);重组蛋白Rv2346c可以增强BCG对RAW264.7细胞增殖的抑制作用(P＜0.05),并降低RAW264.7对BCG的灭活效应(P＜0.05);Rv2346c还可以抑制RAW264.7分泌TNF-α和IL-6(P＜0.05),并抑制NF-κB p65的表达(P＜0.05).结论 重组蛋白Rv2346c可以抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7对BCG的免疫灭活效应,该作用可能与抑制细胞因子分泌和NF-κB p65活化有关,具体机制值得进一步深入探讨.
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编辑人员丨2023/8/6
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噬菌体介导的结核分枝杆菌Rv2346c基因敲除株的构建及其毒力初步研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 利用分枝杆菌噬菌体重组系统构建结核分枝杆菌R v2346 c基因敲除株,体内感染小鼠肺组织,观察R v2346 c基因的毒力,从而探讨结核分枝杆菌R v2346 c基因功能.方法 构建同源交换位点,随后将其整合到结核分枝杆菌噬菌体基因组,获得噬菌粒,将噬菌粒导入耻垢分枝杆菌,获得整合有同源交换位点的重组噬菌体,经体外扩增获得高滴度的重组噬菌体,对结核分枝杆菌进行转染,将转染后的结核分枝杆菌涂布到潮霉素抗性的固体培养基,37℃培养4周,挑取单克隆,通过PCR验证基因敲除成功,将野生株(wild type,WT)及敲除株(knockout,KO)结核分枝杆菌感染C57BL/6J小鼠肺组织,6～8周后观察小鼠死亡率、小鼠肺组织炎性反应程度及肺组织结核分枝杆菌体外培养菌落形成数.两组间比较采用配对t检验,率的比较采用χ2检验.结果 经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符,且为所需目的基因片段,成功切除靶片段,体内感染小鼠6～8周,KO株感染小鼠肺组织后,体外菌落形成数明显低于WT株感染(15.0±0.8比90.0±1.5,t=23.0361,P<0.05),小鼠肺组织炎性反应程度明显轻于WT株感染(1040±89比1960±56,t=7.1016,P<0.05),其小鼠总死亡率明显低于W T株感染(53％ 比20％,χ2=6.1112,P<0.05).结论 成功构建了噬菌体介导的结核分枝杆菌R v2346 c基因敲除株,为R v2346 c基因功能的研究奠定了基础.
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编辑人员丨2023/8/6
