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基于drop-off ddPCR方法检测急性髓系白血病C-KIT基因N822位点突变及其临床应用
编辑人员丨2024/4/27
目的:建立急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者C-KIT基因N822位点突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法,并评价其临床应用价值.方法:针对C-KIT基因第17外显子设计一对引物及探针,优化drop-off ddPCR反应条件及体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,使用所建立的方法对140例已行Sanger测序的AML初诊患者骨髓标本进行检测,并用二代测序(next generation sequencing,NGS)验证结果;用drop-off ddPCR对3例阳性患者化疗后C-KIT突变频率进行动态监测.结果:drop-off ddPCR检测C-KIT基因N822位点突变的最适退火温度为54 ℃,空白检测限为1.62拷贝数/p.L,最低检测下限为10.12拷贝数/μL,线性良好.140例AML初诊患者样本中Sanger测序检出2例阳性(1.4％),而ddPCR共检出突变7例(5.0％),突变频率为0.29％-7.41％;进一步应用常规NGS方法对ddPCR阳性样本进行验证,共检出阳性3例(2.1％),等位基因频率为1.26％-8.00％.动态监测3例阳性患者C-KIT突变频率,结果显示治疗达完全缓解时C-KIT突变频率明显下降甚至降低至0.结论:本研究建立了检测C-KIT基因N822位点突变的drop-off ddPCR技术,具有良好的方法学检测性能,其灵敏度高于Sanger测序和NGS,有望用于阳性患者缓解后的可检测残留疾病监测及治疗指导.
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编辑人员丨2024/4/27
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Drop-off微滴式数字PCR检测急性髓系白血病NRAS基因突变及其临床应用
编辑人员丨2023/8/5
目的:建立检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)基因突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价该方法的临床应用价值.方法:针对NRAS G12和G13突变位点设计特异性drop-off ddPCR引物和探针,建立最佳反应体系,并对该方法进行性能验证.应用该方法对140例临床样本进行初筛,其检测结果与Sanger测序进行比较,并用二代测序(next generation sequencing,NGS)进行验证.结果:建立drop-off ddPCR检测NRAS基因G12/G13突变的方法,灵敏度达0.158％,重复性、线性良好,其空白限为5.40拷贝数/μL,最低检测下限为15.84拷贝数/μL.在140例初诊AML患者中,drop-off ddPCR检出NRAS突变28例(20％),其突变负荷为0.26％～52.85％(中位2.14％);而Sanger测序仅检出7例(5％)阳性,为进一步验证,将21例Sanger测序结果阴性而drop-off ddPCR检测阳性的样本进行NRAS基因NGS,检出14例阳性,而另外7例NGS阴性的样本,其drop-off ddPCR检测突变频率为0.53％～1.50％(中位1.10％).结论:建立了drop-off ddPCR技术检测AML患者中NRAS基因突变的方法,该方法灵敏度高,可用于对NRAS基因G12/G13突变进行定量检测,有望可用于AML患者预后判断和疾病监测.
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编辑人员丨2023/8/5
