目的:克隆幽门螺杆菌(Hp)hp0169基因并进行晶体学研究,分析其二级结构和三维结构.方法:由UniProt数据库中检索Hp NCTC26695菌株hp0169基因及其编码蛋白序列,采用生物信息学方法分析Hp重组胶原蛋白酶(HpPrtC)蛋白理化性质,SOPMA和DNAStrar软件预测HpPrtC蛋白二级结构特征,SWISS-MOPEL软件构建HpPrtC蛋白三维结构,IEDB和ABCpred软件预测HpPrtC蛋白B淋巴细胞抗原表位,SYFPEITHI网站预测T淋巴细胞抗原表位,专家库(EP)算法和随机森林(RF)算法预测HpPrtC蛋白可结晶性.原核表达HpPrtC重组蛋白,经Ni2+亲和层析和分子筛技术纯化蛋白,结晶试剂盒筛选HpPrtC的结晶条件.结果:hp0169基因共包含1 269个碱基配对,编码蛋白全长422个氨基酸,理论等电点为7.64,相对分子质量为47 300.HpPrtC蛋白为亲水性、可溶性蛋白.HpPrtC蛋白α螺旋的氨基酸数量占全部氨基酸数量百分率为35.78%,β片层为18.72%,β转角为 6.87%,无规则卷曲为 38.63%.抗原表位分析,HpPrtC蛋白含有B淋巴细胞的 5个优势线性表位和 3个构象表位及多个T淋巴细胞潜在优势抗原表位.同源建模,HpPrtC蛋白呈二聚体,单体由β折叠围成桶状结构,周围被α螺旋和无规则卷曲围绕.HpPrtC蛋白为中等难度结晶,且无信号肽和跨膜螺旋,在 0.2 mol·L-1 氯化镁、0.1 mol·L-1 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3.4 mol·L-1 己二醇和pH 8.5条件下出现细小成簇的针状晶体.结论:HpPrtC是一种亲水型蛋白,呈二聚体构造,在适宜条件下呈细小成簇针状晶体,其具有T淋巴细胞和B淋巴细胞优势抗原表位,可作为Hp疫苗设计的抗原,用于构建多价融合疫苗或多表位疫苗,本研究结果为Hp的防治提供了实验基础.

目的 异源表达幽门螺杆菌HpPrtC胶原蛋白酶,并检测其对胶原蛋白的降解活性. 方法 根据幽门螺杆菌基因组信息中编号hp0169基因的序列设计引物,PCR扩增HpPrtC基因的核苷酸序列,经NdeⅠ和XhoI酶切后构建原核表达载体pET 22b(+)-HpPrtC,转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用亲和层析法纯化重组蛋白,通过检测重组酶处理胶原蛋白后L-亮氨酸的产生量表征其胶原蛋白降解活性. 结果 HpPrtC基因编码422个氨基酸,与已知PrtC家族蛋白酶氨基酸序列比对最高相似性＜40％.克隆HpPrtC基因连接入表达质粒pET-22b(+),将测序正确的表达质粒pET-22b(+)-HpPrtC转化至感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达相对分子质量约为47×10 3的可溶性蛋白,与预期相符.经亲和层析纯化后的重组蛋白酶降解热变性Ⅰ型胶原蛋白(可溶、不可溶)和天然Ⅰ型胶原蛋白的活性分别为922.2±36.2、1168.8±65.6和674.0±13.4,与幽门螺杆菌培养液中胶原蛋白酶对可溶热变性Ⅰ型胶原蛋白、不可溶热变性Ⅰ型胶原蛋白和天然Ⅰ型胶原蛋白活性分别为205.6±21.5、228.4±19.3和123.2±14.5-致. 结论 幽门螺杆菌定植因子HpPrtC为胶原蛋白酶.通过大肠埃希菌异源表达的重组HpPrtC蛋白具有胶原蛋白酶解活性,为探索该酶在幽门螺杆菌感染定植中的作用机制奠定了基础.

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)hp0169基因的敲除突变株,研究其在Hp感染GES-1细胞中的作用. 方法 敲除质粒pSJHK为模板,通过同源重组双交换的方法构建hp0169基因敲除突变株(△0169),分析其与野生26695株的生长曲线及琼脂表面菌落扩散情况;通过FITC标记法检测两菌株对GES-1细胞的吸附率;以感染复数(MOI=200)构建Hp感染GES-1细胞体系,比较△0169突变株与野生株感染后致细胞凋亡及细胞活性变化的差异. 结果 通过质粒敲除、电击转化成功获得hp0169基因敲除突变株△0169.该突变株与野生菌株的生长曲线、琼脂表面菌落扩散情况基本一致,对GES-1细胞的吸附率差异无统计学意义(t值为1.102,P＞0.05).△0169突变株与野生株感染GES-1细胞活力分别为6 h(0.74±9.56)％、(0.90±6.31)％,12 h(0.53±7.89)％、(0.73±8.31)％,差异均有统计学意义(t值分别为-3.474,-2.880,P＜0.05);野生组和突变组GES-1细胞凋亡率分别为6 h(19.2±11.03)％、(20.4±8.67)％和12 h(29.3±14.47)％、(28.6±10.32)％,差异均无统计学意义(t值分别为-0.995,0.218,P＞0.05). 结论 Hp hp0169基因敲除后不影响其生长、运动以及对GES-1细胞的吸附,不影响细菌感染GES-1细胞致细胞凋亡的程度,但影响细菌感染致细胞活力下降的程度.这对研究Hp感染及致病机制有重要意义.