目的 本课题组近年报道了非二噁英样多氯联苯化合物对哺乳动物细胞的致突变作用,且作用依赖于人细胞色素P450(CYP)2E1酶的代谢活化;本研究进一步探讨非二噁英样化合物2,4,4'-三氯联苯(PCB28)的致突变作用.方法 采用CCK8法、微核实验和Hprt致突变实验检测PCB28对中国仓鼠V79和重组表达人和硫酸基转移酶(SULT)1A1的V79衍生细胞(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)的细胞毒性和遗传毒性,并利用酶抑制剂观察重组表达的酶对于受试物毒效应的影响.结果 PCB28(5～40 μmol/L)经12 h染毒、12 h恢复,对V79-Mz和V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞均无细胞毒作用,1-氨基苯并三唑(60 μmol/L,CYP抑制剂)和五氯苯酚(10 μmol/L,SULT1抑制剂)的与受试物同时暴露于V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞对细胞活力影响甚微.PCB28在5～20 μmol/L对V79-Mz细胞没有诱发微核的作用,但对V79-hCYP2E1-hSUT1A1细胞则明显增加其微核细胞率(P＜0.05),且具有浓度依赖效应;此作用可被1-氨基苯并三唑明显降低,而被五氯苯酚明显增强.PCB28(10～40 μmol/L)对V79-Mz细胞Hprt基因突变频率无影响,对V79-hCYP2E1-hSUT1A1细胞则诱发基因突变频率增加(P＜0.05),其作用呈浓度相关性.结论 PCB28可能经CYP2E1酶活化为致突变性代谢物,后者可由人SULT1A1酶代谢减毒;同其他非二噁英样多氯联苯类似,PCB28可能是一个由人CYP2E1酶活化的前致突变物.

目的:构建水通道蛋白4 (AQP4)真核表达载体pmCherry-N1-hAQP4-M23,检测AQP4-M23蛋白在中国仓鼠肺细胞系V79中的表达.方法:采用PCR方法扩增hAQP4-M23基因,经双酶切后与真核表达载体pmCherry-N1连接,构建pmCherry-N1-hAQP4-M23重组表达质粒.采用脂质体将其转染至V79细胞中,将细胞随机分为对照组(未转染重组质粒的V79细胞)和转染组(转染重组质粒的V79细胞).利用RT-PCR法和荧光显微镜检测2组细胞中hAQP4-M23基因的表达;取视神经脊髓炎(NMO)患者血清中抗AQP4抗体,与2组细胞结合,采用免疫荧光和水通透性法检测2组细胞中hAQP4-M23的活性.结果:成功构建AQP4真核表达载体;荧光显微镜观察,转染组细胞膜清晰表达红色荧光;免疫荧光检测,转染组细胞膜呈现绿色荧光,表明转染组细胞膜AQP4-M23蛋白可与NMO患者血清成分结合;与对照组比较,转染组细胞中hAQP4-M23活性升高(P＜0.05).结论:成功构建表达AQP4基因的真核表达载体,并在V79细胞系中成功表达hAQP4-M23蛋白.

目的 了解多氯联苯化合物诱发哺乳动物细胞次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)基因的分子突变谱.方法 采用自行构建的重组中国仓鼠肺细胞株(V79-hCYP2E1-hSULT1 A1),用空2,4,4'-三氯联苯(PCB 28) (10、20、40μmol/L)、2,2',5,5'-四氯联苯(PCB 52)(80 μmol/L)和阳性对照N-二乙基亚硝胺(NDEA,200μmol/L)染毒,实验结束后收集突变克隆进行细胞扩增,提取细胞总RNA,逆转录得cDNA,采用PCR扩增Hprt基因片段,并进行基因测序,统计分析各化学物诱发突变发生率及分子突变谱.结果 对照组细胞Hprt基因的自发突变中单个碱基置换占88.2％,PCB 28诱发的突变除单碱基置换外,呈现多类型突变特征,包括两个以上碱基置换、外显子缺失、移码突变及小缺失;随着PCB 28浓度增加,单碱基置换所占比例呈下降趋势,即由68.8％下降到33.3％;并且高浓度时以小缺失为主要突变类型(占66.7％).PCB 52和NDEA诱发突变类型则类似自发突变组.自发突变的单碱基置换主要为A∶T→G∶C改变,而PCB 28(20 μmol/L)诱发的碱基置换主要为G∶C→A∶T.PCB 28组(20 μmol/L)突变克隆细胞平均碱基置换次数高于自发突变组.结论 PCB 28诱发突变呈现多类型突变特征,与自发突变的分子突变谱有差异,可能与该化合物特异的致突变机理有关.