目的:探讨在肺腺癌中含SAM域和HD域蛋白1（SAMHD1）与程序性死亡配体-1（PD-L1）表达的相关性。方法:通过在线数据库GEPIA和Kaplan-Meier Plotter分析SAMHD1在肺腺癌中的表达及对预后的影响。通过实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹法检测SAMHD1在多个肺腺癌细胞株中的表达。利用小干扰RNA转染及慢病毒感染技术分别对H1975、H1299及LLC细胞进行SAMHD1基因沉默，通过qPCR、蛋白质印迹法检测对照组、siSAMHD1-1组和siSAMHD1-2组肺腺癌细胞中PD-L1 mRNA及蛋白表达水平，用流式细胞术检测细胞膜PD-L1的表达水平。构建小鼠肺腺癌移植瘤模型，用免疫组织化学法检测对照组和shSAMHD1组移植瘤组织中PD-L1的表达。用CCK-8检测对照组、siSAMHD1-1组和siSAMHD1-2组肺腺癌细胞增殖活力。结果:GEPIA数据库结果表明，SAMHD1 mRNA在肺腺癌中的表达较肺正常组织低（4.81±0.90 vs. 5.99±0.76， t=20.67， P<0.001）。SAMHD1高表达患者中位总生存期明显长于低表达患者（109.0个月 vs. 87.7个月， χ2=26.83， P=0.002）。A549、PC9、H1299和H1975细胞中SAMHD1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.02、0.75±0.05、3.49±0.19和7.25±0.38（ F=589.00， P<0.001），蛋白相对表达量分别为1.00±0.06、0.34±0.07、1.67±0.22和2.11±0.63（ F=15.79， P=0.001）。H1975细胞中，对照组、siSAMHD1-1组和siSAMHD1-2组的PD-L1 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.00、1.54±0.26、2.89±0.13（ F=102.30， P<0.001），蛋白相对表达水平分别为1.00±0.01、1.50±0.10和1.52±0.33（ F=6.65， P=0.030）；H1299细胞中，3组的PD-L1 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.08、1.63±0.03和2.14±0.03（ F=368.80， P<0.001），蛋白相对表达水平分别为1.00±0.07、1.88±0.35和2.05±0.38（ F=10.66， P=0.011），siSAMHD1-1组和siSAMHD1-2组PD-L1表达水平均高于对照组（均 P<0.05）。流式细胞术结果表明，H1975细胞中，对照组、siSAMHD1-1组和siSAMHD1-2组膜PD-L1荧光强度分别为246.83±27.59、325.60±8.00和308.93±7.60（ F=17.56， P=0.003）；H1299细胞中，3组的荧光强度分别为959.00±6.25、1 084.33±7.64和1 085.33±21.22（ F=86.74， P<0.001），siSAMHD1-1组和siSAMHD1-2组荧光强度均高于对照组（均 P<0.05）。在小鼠移植瘤模型中，shSAMHD1组PD-L1的H-SCORE评分高于对照组（7.99±1.10 vs. 4.49±0.43， t=5.13， P=0.007）。H1975细胞中，对照组、siSAMHD1-1组和siSAMHD1-2组72 h细胞增殖活力分别为0.50±0.02、0.75±0.05和0.73±0.06（ F=25.01， P=0.001）；H1299细胞中，3组72 h细胞增殖活力分别为0.80±0.01、1.00±0.04和0.93±0.07（ F=13.90， P=0.006），siSAMHD1-1组和siSAMHD1-2组细胞增殖活力均高于对照组（均 P<0.05）。 结论:在肺腺癌中，沉默SAMHD1可以提高PD-L1的表达。

不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1(sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain containing protein 1,SAMHD1)是由真核生物SAMHD1基因编码,由626个氨基酸组成的蛋白,总长度1878bp[1],该蛋白主要包含N-端核定位信号区(NLS)、不育α基序(SAM)结构域、组氨酸/天冬氨酸残基(HD)结构域、T592磷酸化位点以及C-端可变区(Vpx结区)[2].

目的 阐明苏氨酸592(Thr592)位点磷酸化修饰对不育α基序和含HD结构域蛋白1(SAMHD1)抑制胃癌增殖的影响以及潜在的作用机制.方法 分析数据库中胃癌组织和细胞系中SAMHD1蛋白的翻译后修饰(PTMs),免疫组织化学染色检测胃癌患者配对组织中SAMHD1 Thr592磷酸化情况.在胃癌细胞中,构建并瞬时转染SAMHD1 Thr592变异体,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增殖.加用不同浓度细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)6抑制剂帕博西尼(Palbociclib),抑制下游CDK2蛋白苏氨酸160(Thr160)位点的磷酸化,降低SAMHD1蛋白Thr592磷酸化水平.利用3个在线数据库分析SAMHD1的互作蛋白并取交集得出Nik相关激酶(NRK)蛋白.采用免疫共沉淀(Co-IP)、质谱分析和Western blot验证SAMHD1与NRK蛋白互作,并检测NRK对SAMHD1 Thr592位点磷酸化的影响.结果 与类泛素化等PTMs比较,肿瘤中SAMHD1的磷酸化修饰水平最高,差异有统计学意义(P<0.01),免疫组化实验显示,磷酸化SAMHD1(Thr592)在胃腺癌中表达高于癌旁正常黏膜组织,差异有统计学意义(P<0.01).Western blot检测结果显示在MKN-45细胞中过表达野生型和突变体组细胞内的SAMHD1蛋白表达升高,野生型、T592E和HD/AA组中磷酸化SAMHD1水平也升高,CCK-8实验表明,SAM-HD1野生型和T592A均能抑制胃癌细胞增殖,而T592E和HD/AA对胃癌增殖无影响.在过表达SAMHD1基础上,加入不同浓度Palbociclib处理后,CCK-8提示细胞增殖受到抑制,且Western blot检测提示磷酸化水平也降低.通过Co-IP和质谱鉴定来筛选SAMHD1的互作蛋白谱和数据库交集取得NRK蛋白,Co-IP和Western blot实验结果提示NRK与SAMHD1蛋白互作,促进SAMHD1 Thr592位点发生磷酸化.结论 Thr592位点磷酸化修饰可能会促使SAMHD1失去抑制胃癌细胞增殖的能力,但是这一过程可被Palbociclib逆转;NRK与SAMHD1蛋白互作,促进SAMHD1 Thr592位点发生磷酸化.