目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:分离可裂解烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体，研究其生物学特性、基因组信息及对细菌生物膜的作用。方法:(1)2018年，取分离自上海交通大学医学院附属瑞金医院(下称瑞金医院)烧伤患者血液的泛耐药肺炎克雷伯菌UA168(下称宿主菌)液，采用污水共培养法及滴板法和双层琼脂平板法，从瑞金医院污水中分离纯化得到烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体，将其命名为噬菌体KP168，观察其噬菌斑形态。(2)取噬菌体KP168液行氯化铯密度梯度离心和透析后，采用磷钨酸负染法通过透射电子显微镜观察噬菌体KP168形态。(3)取噬菌体KP168液，采用滴板法检测其对从瑞金医院烧伤患者血液中分离得到的20株泛耐药肺炎克雷伯菌的裂解能力，计算裂解率。(4)分别以感染复数为10.000、1.000、0.100、0.010和0.001共同常规振荡培养初始效价为9.3×10 11噬菌斑形成单位(PFU)/mL噬菌体KP168液(每管400 μL)和浓度为1×10 9集落形成单位(CFU)/mL宿主菌液(每管4 mL)4 h(每种感染复数1管)，采用双层琼脂平板法测算噬菌体KP168效价(测算方法下同)以筛选最佳感染复数，实验重复3次。(5)以感染复数为0.005混合浓度为1×10 9 CFU/mL宿主菌液(每管4 mL)和效价调整为5×10 7 PFU/mL噬菌体KP168液(每管400 μL)，分别于混合后0(即刻)、1、2、3、4、5、15、30 min(每个时间点1管)采用双层琼脂平板法计数噬菌斑(计数方法下同)，计算已吸附噬菌体百分比以筛选最佳吸附时间，实验重复3次。(6)以感染复数为0.005混合浓度为1×10 9 CFU/mL宿主菌液(每管300 μL)和效价调整为5×10 8 PFU/mL噬菌体KP168液(每管60 μL)，静置最佳吸附时间后常规振荡培养，分别于培养0(即刻)、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min测算噬菌体KP168效价，绘制一步生长曲线，实验重复3次。(7)取效价为2.5×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液，分别于37、40、50、60、70 ℃静置培养1 h(每个时间点3管，每管1 mL)，计数噬菌斑并绘制热稳定曲线。取效价为3.0×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液，分别加入pH值为5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、10.0的SM缓冲液于37 ℃静置培养1 h(每种pH值3管，每管含100 μL噬菌体KP168液、900 μL SM缓冲液)，计数噬菌斑并绘制酸碱稳定曲线。(8)取噬菌体KP168液同实验(2)透析后行DNA抽提与测序，用Prokka对全基因组进行注释以获得噬菌体KP168编码序列，使用Nucleotide BLAST功能进行核酸序列比对以寻找与噬菌体KP168核酸序列相似度最高的已知噬菌体，使用Blastx功能将编码序列翻译成蛋白质后进行功能预测，比对抗性基因数据库和毒力因子数据库。(9)于96孔板中，分别以感染复数为1.000、0.100、0.010和0.001，在浓度为1.5×10 8 CFU/mL(浓度下同)的200 μL宿主菌液中加入初始效价为5.8×10 10 PFU/mL噬菌体KP168液20 μL(每种感染复数3孔)共同培养48 h；将200 μL宿主菌液静置培养48 h后，分别加入效价为1×10 6、1×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10 PFU/mL的噬菌体KP168液20 μL(每种效价3孔)静置作用4 h。2种实验均以200 μL宿主菌液中加入SM缓冲液20 μL(3孔)为阴性对照，以220 μL LB培养液(3孔)为空白对照，均采用酶标仪测定吸光度值并分别计算生物膜抑制率和生物膜破坏率，实验均重复3次。 结果:(1)成功分离纯化噬菌体KP168，其噬菌斑透亮，呈圆形，直径约1.5 mm。(2)噬菌体KP168呈正多面体结构，直径约为50 nm，无尾部结构。(3)噬菌体KP168可裂解20株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌中的13株，裂解率为65.0%。(4)感染复数为1.000时，噬菌体KP168与宿主菌共同培养4 h后，效价最高，以此为最佳感染复数。(5)噬菌体KP168与宿主菌混合后4 min，已吸附噬菌体百分比最高，以此为最佳吸附时间。(6)一步生长曲线表明噬菌体KP168裂解宿主菌时，潜伏期约10 min，裂解期约40 min。(7)噬菌体KP168在40 ℃、pH值为7.4时，噬菌斑数最多，活性最大。(8)噬菌体KP168基因组是线状双链DNA，长度为40 114 bp；有48个可能编码序列；与Klebsiella phage_vB_Kp1相似度最高；编码序列翻译蛋白对应的已知最相似蛋白中包含23个假设蛋白和25个已知功能蛋白；未见抗性基因和毒力因子基因；获得GeneBank登录号MN585130。(9)以各感染复数共同培养噬菌体KP168与宿主菌48 h后，生物膜抑制率相近，平均约为45%；效价为1×10 9 PFU/mL噬菌体KP168作用于宿主菌已形成的生物膜4 h后，生物膜破坏率最高，达平均42%。 结论:本研究自污水中分离得到1株烧伤患者泛耐药肺炎克雷伯菌噬菌体——噬菌体KP168，该株噬菌体属于无尾科噬菌体，宿主谱宽、吸附时间短、潜伏期短，具有一定的热和酸碱稳定性；其基因组信息明确，不含抗性基因及毒力因子基因；对细菌生物膜的形成有抑制作用，对已形成的细菌生物膜有破坏作用。

目的:分离提纯1株新型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的噬菌体，并对其基因组学信息和生物学特性进行分析。方法:采用实验研究方法。取分离自陆军军医大学（第三军医大学）第二附属医院收治的1例胸骨正中切口感染的63岁女性患者创面的MRSA（下称宿主菌）液，采用污水共培养法和双层琼脂平板法从该院污水中分离提纯得到噬菌体，并命名为噬菌体SAP23，观察噬菌斑形态。采用磷钨酸负染法将噬菌体SAP23染色，采用透射电子显微镜观察其形态。采用十二烷基磺酸钠/蛋白酶裂解方案制备噬菌体SAP23 DNA，在Illumina NovaSeq PE150平台下进行全基因组测序，并完成序列组装、注释、系统发生树等基因组学分析。将噬菌体SAP23液分别按10.000 0、1.000 0、0.100 0、0.010 0、0.001 0、0.000 1感染复数与宿主菌液共培养4 h后，采用点滴法测定噬菌体效价，筛选最佳感染复数，此处及以下样本数均为3。按测得的最佳感染复数取噬菌体SAP23液与宿主菌液分别共同孵育5、10、15 min后，同前测定噬菌体效价，筛选最佳吸附时间。按测得的最佳感染复数取噬菌体SAP23液与宿主菌液按最佳吸附时间孵育后，分别于培养0（即刻）、5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、120 min，同前测定噬菌体效价，绘制一步生长曲线。取噬菌体SAP23液分别在温度为4、37、50、60、70、80 ℃下，在pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12下孵育1 h，测定稳定性。取陆军军医大学（第三军医大学）微生物教研室储存的41株MRSA，完成噬菌体SAP23的宿主谱范围检测。结果:噬菌体SAP23能在宿主菌双层琼脂板上形成透明噬菌斑。噬菌体SAP23头部是直径为（88±4）nm的多面体，其尾部长度为（279±21）nm、宽度为（22.6±2.6）nm。噬菌体SAP23基因组为全长151 618 bp的线状双链DNA，序列两端有11 681 bp的长末端重复序列，预测出220个开放阅读框，噬菌体可编码4个转运RNA，未预测出毒力因子或抗性基因，注释功能的噬菌体SAP23基因可分为5个组，GenBank登录号为MZ427930，噬菌体SAP23全基因组序列与共线性分析中的6个葡萄球菌噬菌体全基因组序列有5个局部共线区域，但在局部共线区域内部或外部存在差异。噬菌体SAP23属于 Herelleviridae科 Twortvirinae亚科 Kayvirus病毒属。噬菌体SAP23的最佳感染复数为0.010 0，最佳吸附时间为10 min，潜伏期约为20 min，裂解期约为80 min；在4~37 ℃温度条件及pH值为4~9的条件中，稳定性较好。噬菌体SAP23可裂解41株MRSA中的3株。 结论:噬菌体SAP23为 Herelleviridae科 Twortvirinae亚科 Kayvirus病毒属成员，潜伏期短，其对温度和酸碱耐受性好，可有效裂解MRSA，为不含毒力因子和抗性基因的新型烈性窄谱噬菌体。

目的:分离1株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)噬菌体，评估生物学特性和抗菌性能，并用于小鼠创面MRSA感染治疗。方法:苏北人民医院污水站收集污水，共培养法和双层琼脂平板法从该污水中分离MRSA噬菌体SBSS-1，观察噬菌斑形态、大小。透射电子显微镜(TEM)观察其微观形貌，并测量大小。测定其最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线、不同pH、不同温度增殖活性。细菌活死染色、扫描电子显微镜(SEM)观察其抗菌性能。将噬菌体SBSS-1治疗创面MRSA感染小鼠，马松染色评价胶原水平，酶联免疫试剂盒检测炎性因子，免疫荧光检测血管、肉芽组织形成标志物，Image J 6.0软件分析荧光强度。两组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果:成功分离噬菌体SBSS-1，可形成大小为2.7~4.2 mm的透明噬菌斑。头部为正二十面体，直径(73±5) nm，连接长(201±17) nm、宽(18±5) nm的非可收缩性尾巴。属于有尾噬菌体目(Caudovirales)，长尾噬菌体科(Siphoviridae)。最佳MOI为0.1，潜伏期为20 min，裂解期为40 min，平均裂解量72 PFU/Cell；在4 ℃~50 ℃、pH 3~11，活性稳定。其可破坏MRSA膜结构，使大部分细菌呈红色荧光，并使MRSA皱缩，损伤。噬菌体SBSS-1组创面直径显著低于对照组[(0.16±0.04) cm比(0.55±0.03) cm， t＝22.06， P<0.05]；噬菌体SBSS-1组胶原沉积较对照组增多；噬菌体SBSS-1组创面创面肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6表达水平显著低于对照组[(100.30±9.87) pg/ml比(310.00±26.46) pg/ml， t＝7.425， P<0.05；(33.33±4.67) pg/ml比(126.00±7.94) pg/ml， t＝10.060， P<0.05；(197.00±10.44) pg/ml比(711.00±45.45) pg/ml， t＝11.020， P<0.05]；噬菌体SBSS-1组小鼠创面白细胞介素-10表达水平显著高于对照组[(130.30±10.59) pg/ml比(27.33±7.54) pg/ml， t＝7.926， P<0.05]；噬菌体SBSS-1组创面细胞增殖标志物细胞核增殖抗原(Ki-67)抗原荧光强度显著高于对照组(222.70±16.76比62.67±4.70， t＝9.193， P<0.05)；噬菌体SBSS-1组创面血小板内皮细胞黏附分子荧光强度显著高于对照组(200.70±10.81比43.00±2.31， t＝14.270， P<0.05)。 结论:成功分离MRSA噬菌体SBSS-1，抗菌效果显著，能够促进MRSA感染创面愈合。

随着耐药性肺炎克雷伯菌的增多,噬菌体的潜力逐步被发掘.裂解酶在噬菌体裂解宿主菌时起到了重要作用,作为外源纯化蛋白使用时,防控效果更为显著.现有研究中,针对革兰阳性菌噬菌体裂解酶的表达更多,因其不具有革兰阴性菌细胞壁外层的肽聚糖层,而对肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌等革兰阴性菌的噬菌体裂解酶研究仍较为罕见.但已有研究表明,多种策略可以克服其肽聚糖层带来的阻碍.本文主要综述了近年来用于防控肺炎克雷伯菌的噬菌体裂解酶及其作用机制和防控优势,旨对其后续研究提供思路.

[背景]抗生素耐药问题是影响人类及养殖业健康的重要因素,噬菌体能特异性裂解细菌,成为抗生素替代品研究热点,是解决抗生素耐药难题、促进养殖业健康发展的新途径.[目的]通过研究绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体φPTK(phage target of K1)的分子生物学特性,同时利用小鼠感染模型研究φPTK对小鼠大肠杆菌感染的防治效果,为绒山羊大肠杆菌病的防控提供新策略.[方法]用聚乙二醇-氯化钠(PEG 8000-NaCl)浓缩φPTK后,采用透射电子显微镜观察其超微形态结构;运用苯酚-氯仿法提取 φPTK 核酸后通过 Illumina HiSeq 高通量测序分析其全基因组结构,使用Mauve比较基因组学分析,通过MEGA绘制噬菌体进化树;通过构建小鼠感染模型分析φPTK对小鼠感染大肠杆菌的防治效果.[结果]透射电镜显示φPTK头部为正多面体形,直径 90 nm,有长约 112 nm、直径约 18 nm的可收缩长尾;φPTK基因组全长 169688 bp,GC含量 37.72%,有264 个开放阅读框,含穿孔素-裂解酶(holin-lysin)裂解系统,有抗穿孔素蛋白和裂解抑制辅助蛋白,未发现抗生素耐药基因和毒力基因;比较基因组分析表明,φPTK为一株新的绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体;小鼠大肠杆菌感染前和感染后分别使用φPTK进行预防和治疗的试验表明,未使用φPTK的阳性对照组小鼠全部死亡,预防组和治疗组小鼠存活率分别为 80%和 60%.[结论]噬菌体φPTK是一株能够在小鼠大肠杆菌感染中具有较好预防效果的有尾噬菌体目(Caudovirales)肌尾噬菌体科(Myoviridae)绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体,本研究为绒山羊噬菌体生物制剂的创制奠定了基础.

目的 从医院废水中筛选并鉴定铜绿假单胞菌烈性噬菌体,表达和优化其裂解酶.方法 以收集的临床铜绿假单胞菌为宿主菌,分离纯化烈性噬菌体,并深入鉴定其中一株裂解能力强的广谱噬菌体的生物学特性,分析其基因组特征和进化特征,表达和改造噬菌体裂解酶,测定噬菌体与抗生素的协同杀菌作用以及不同穿膜辅助剂对于裂解酶杀菌活性的影响.结果 噬菌体vB_PaeM-YQ78是一株新的铜绿假单胞菌肌尾噬菌体,潜伏期为10 min,裂解量为43;最佳感染复数为0.00001;在40℃以下和pH 5～10范围内保持稳定.噬菌体与环丙沙星具有较强的协同作用,在24 h内无突变菌株生长.不使用穿膜辅助剂时,裂解酶LysYQ78在1 h内能将多重耐药铜绿假单胞菌降低1个log单位,在添加5 mmol/LEDTA时,LysYQ78可以将细菌浓度降低6个log单位.将ApoE蛋白N端穿膜肽融合到LysYQ78的N端后,Lys1410-YQ78的杀菌活性得到显著提高,可以在1 h内将宿主菌浓度降低2个log单位.结论 本实验分离鉴定了一株新的铜绿假单胞菌烈性噬菌体,其具有较宽的宿主谱,与环丙沙星具有较强的协同作用.并且,其裂解酶本身就可以穿透细胞外膜,展现杀菌活性,而与穿膜肽融合后,杀菌活性得到显著增强.本实验的裂解酶改造为进一步优化提供了思路,为将来铜绿假单胞菌的噬菌体治疗提供新的选项.

目的 以实验室保存菌株Pa175为宿主菌,从医院污水中分离得到1株铜绿假单胞菌噬菌体,研究其生物学特性及全基因组学特征.方法 利用双层平板法、噬斑法分离并鉴定噬菌体;PEG8000浓缩NaCl沉淀法纯化噬菌体;蔗糖梯度离心进一步纯化噬菌体,经磷钨酸负染染色后,使用透射电子显微镜观察其形态;蛋白酶K/SDS法提取噬菌体DNA,对提取的核酸进行全基因组测序和生物信息学分析.结果 得到1株裂解性铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaS_IME307,该噬菌体可以形成透明且有晕环的噬菌斑,全基因组大小为51 545 bp.透射电镜结果显示vB_PaS_IME307的头部呈正二十面体形状,直径(66±2)nm,尾长(116±2)nm;进化树分析发现该噬菌体为Mccleskeyvirinae病毒属,长尾噬菌体科(Siphoviridae).生物学特性研究发现:vB_PaS_IME307在pH=4.0～11.0、60℃以下能够保持较高活性,感染周期约为60 min,其中包括10 min潜伏期和50 min暴发期,其暴发量为150 PFU/cell.结论 噬菌体vB_PaS_IME307具有宿主特异性,对温度和pH具有较好的耐受能力,具有防治铜绿假单胞菌细菌感染的潜力.

随着临床上广泛耐药菌株的检出率逐年升高,新型抗菌药物需求日益迫切.越来越多的研究者们将注意力集中到噬菌体治疗上,并在这个领域取得了较大的进展.大量的研究表明,一些噬菌体能够产生降解细菌胞外聚合物基质的多糖解聚酶,继而裂解并杀死宿主菌.该文综述了噬菌体多糖解聚酶的分类和作用方式,判断噬菌体是否产生解聚酶的方法,以及该酶在治疗细菌性感染、降解生物膜和细菌荚膜分型上的应用.

目的 分离鲍曼不动杆菌噬菌体,测定其基因组DNA序列,分析预测穿孔素和裂解酶等重要功能基因及其编码蛋白的性质和功能.方法 利用双层琼脂平板法从医院污水中分离鲍曼不动杆菌噬菌体,透射电子显微镜观察噬菌体的形态特征;提取噬菌体基因组DNA,采用Illumina Hiseq2000测序仪进行全基因组测序;利用生物信息学方法对噬菌体基因组DNA序列进行功能编码基因定位、同源性分析以及对噬菌体重要功能基因编码蛋白的结构和生物功能等进行预测.结果 成功从医院污水中分离获得1株鲍曼不动杆菌噬菌体,命名为噬菌体SWH-Ab-1.噬菌体SWH-Ab-1属长尾噬菌体,对鲍曼不动杆菌具有显著裂解性.噬菌体SWH-Ab-1基因组为全长41 567 bp的双链DNA,G+C％含量为39.42％,包含51个预测功能基因,穿孔素基因和裂解酶基因分别位于噬菌体基因组的ORF02(320 ～655 bp)和ORF03(642～1 199 bp)开放阅读框,穿孔素基因序列全长336 bp,共编码111个氨基酸,其编码的HolSA1为疏水性Ⅰ型跨膜蛋白,相对分子质量为11.957 96×103,理论等电点为4.87,可能在脂肪酸代谢、转运载体及信号转导中发挥重要作用.裂解酶基因序列全长558 bp,共编码185个氨基酸,其编码的LysSA1为亲水性蛋白,相对分子质量为21.010 4×103,理论等电点为9.56,无跨膜区,可能参与氨基酸生物合成、脂肪酸代谢、辅因子生物合成等重要生理过程.两种功能蛋白均不存在信号肽序列,二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主.结论 噬菌体SWH-Ab-1是一种新分离的长尾裂解性噬菌体,其基因组的ORF02和ORF03开放阅读框是穿孔素和裂解酶的编码基因,编码的HolSA1和LysSA1可能组成“二元裂解系统”,协同参与噬菌体对宿主菌的裂解过程.