目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的 研究脐带间充质干细胞来源的外泌体(MSCs-Exo)对乳腺癌细胞生长的影响.方法 利用生物发光成像技术的双报告基因(萤火虫荧光素酶-绿色荧光蛋白,Fluc-GFP)载体,通过慢病毒转染构建人乳腺癌MDA-MB-231细胞系(231-Fluc-GFP),以便在体内可以对细胞进行实时监测.分别采用MSCs-Exo(MSCs-Exo组)和PBS(对照组)处理细胞,体外实验对2组细胞进行形态学观察、增殖、存活、STAT3及其下游基因表达的检测;通过皮下注射2组细胞建立裸鼠体内乳腺癌模型,对不同处理条件下的细胞成瘤情况进行分析.结果 体外实验结果显示MSCs-Exo处理后乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖受到了抑制,在处理第3天时2组细胞数差异有统计学意义(P<0.05);处理后细胞存活率降低(P<0.01);外泌体处理组STAT3及其下游基因C-MYC,BCL-XL,NANOG,OCT4,SOX2表达下降.体内实验结果显示MSCs-Exo处理组肿瘤细胞在体内的生长受到抑制.结论 脐带间充质干细胞来源的外泌体抑制乳腺癌细胞的生长.

目的 构建固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础.方法 利用生物信息学软件,对SREBP1基因5′端上游5000 bp序列进行启动子预测与分析.应用Gibson Assembly方法构建启动子双荧光素酶载体,并将构建成功的pGL3-SREBP1-pro重组质粒和内参质粒pRL-SV40共转染肝癌HepG2细胞并给予天然抑制剂大黄素,检测SREBP1转录活性的抑制效果.结果 SREBP1基因5′端上游2000 bp区域内有启动子特征序列,存在转录因子结合位点;重组质粒经酶切及测序鉴定证实为阳性克隆,瞬时转染肝癌HepG2细胞后经双荧光素酶报告基因系统检测,所克隆的片段序列具有启动子活性,该活性可被大黄素所抑制.结论 成功构建了pGL3-SREBP1-pro双荧光素酶报告基因表达载体,并证实其活性,可为进一步用于针对SREBP1靶点的天然活性抑制剂筛选奠定基础.

目的 探讨病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)表达的影响及其机制.方法 转染vMIP-Ⅱ质粒(vMIP-Ⅱ质粒组)、空质粒(空质粒组)至293T细胞.定量PCR和Western印迹法分析转染vMIP-Ⅱ基因对293T细胞APOBEC3G表达的影响.空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组细胞分别加入1 000 IU/ml干扰素α(IFN-α),培养36 h后,Western印迹法检测空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+IFN-oα组APOBEC3G的蛋白水平.对转染vMIP-Ⅱ质粒的293T细胞,分别用75μmol/L JAK/STAT信号通路抑制剂AG490和20 μmol/LERK信号通路抑制剂U0126处理,24h后收集细胞总蛋白,Western印迹法检测APOBEC3G蛋白水平.构建包含APOBEC3G启动子的荧光素酶报告基因重组质粒,启动子片段包括APOBEC3G全长启动子序列(POS)与长度1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp序列及APOBEC3G启动子序列中不含调控元件的区域(NEG),将荧光素酶报告基因重组质粒和vMIP-Ⅱ质粒共转染293T细胞为实验组,以与空质粒共转染的293T细胞为对照,检测APOBEC3G启动子活性,分析vMIP-Ⅱ调控APOBEC3G转录活性的关键启动子作用区域.统计学比较采用t检验、单因素方差分析、LSD-t检验.结果 vMIP-Ⅱ转染组APOBEC3G mRNA、蛋白水平(2.500±0.013、1.472±0.013)均高于对照组(1、0.364±0.030,t值分别为6.22、6.54,均P＜0.05).空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+IFN-α组APOBEC3G水平(分别为1、2.030±0.108、2.700±0.081、2.600±0.099)差异有统计学意义(F=67.026,P＜0.001),vMIP-Ⅱ质粒组与空质粒+IFN-α组差异无统计学意义(t=3.46,P＞0.05).vMIP-Ⅱ质粒组、vMIP-Ⅱ质粒+AG490组、vMIP-Ⅱ质粒+U0126组APOBEC3G水平(0.617±0.025、0.179±0.061、0.359±0.012)差异有统计学意义(F=70.019,P＜0.001),后两组均低于vMIP-Ⅱ质粒组(t值分别为9.66、11.836,P＜0.01).荧光素酶活性检测显示,转染了POS、1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp及NEG序列的vMIP-Ⅱ质粒组启动子活性差异有统计学意义(F=81.092,P＜0.001),从720 bp片段至480 bp片段,APOBEC3G启动子活性降低幅度巨大.结论 vMIP-Ⅱ上调APOBEC3G的表达,可能是通过JAK/STAT信号通路或作用于APOBEC3G转录活性的关键启动子区域.

目的 建立一种高效慢病毒转染小鼠肺的方法.方法 采用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和萤光素酶(luciferase,Luc)双基因标记慢病毒载体,通过293 FT细胞体外包装带有报告基因的慢病毒颗粒.选取BALB/c小鼠30只,每组15只,随机分为高压喷雾注射组和普通注射组,小鼠手术暴露气管,经气道注射报告基因标记的慢病毒颗粒,观察慢病毒转染至肺后2、4、6、8、10、12h小鼠存活率和呼吸系统表现,并在转染后24 h体外活体荧光成像仪检测报告基因在小鼠体内的发光强度.结果 荧光显微镜下观察,见多数细胞表达GFP,并见细胞融合现象,少量细胞悬浮,病毒滴度为5×107U/ml.活体荧光成像结果显示,与普通注射方法相比,高压喷雾注射组报告基因荧光强度均匀分布在肺中,荧光强度较高,两组间表达强度比较差异有统计学意义(P=0.0095);且高压喷雾注射组小鼠气促、鼻唇黏膜发绀(cyanosis)较普通注射组恢复快,两组12h存活率分别为80％和50％.结论 高压喷雾注射技术转染慢病毒颗粒至小鼠肺的技术更为高效,可用于建立外源基因小鼠肺转染模型.