目的 对目前已有心肌纤维化染色方法进行优化,弥补目前心肌纤维常用染色方法在定量分析中存在的胶原纤维漏读及误读等问题,为心肌纤维化半定量及诊断提供参考.方法 利用实验室前期构建的心肌组织特异性cTnTR141W 基因突变致扩张型心肌病转基因小鼠模型,制备心脏组织石蜡切片,分别进行马松三色(Masson's trichrome,Masson)染色法、天狼星红(picric sirius red,PSR)染色法、天狼星红-品红(van Gieson,VG)染色法、天狼星红-固绿(sirius red/fast green staining,SR/FG)染色法染色,利用Image J 2.1.0 软件对胶原纤维面积进行定量比较,并从染液浓度、染色时间、酸性溶液预染 3 个方面对SR/FG染色法进行优化,对后续的胶原纤维定量分析进行应用验证.结果 4 种特染方法均可实现胶原纤维的分布观察,其中,优化后的SR/FG染色法,即 0.1%天狼星红-苦味酸酸性溶液预染 5 min,随后于 0.1%天狼星红-苦味酸与 0.04%固绿的混合液中染色 1h,在软件识别中具有更低的漏读率和遗失率.结论 本文优化后的SR/FG染色法较其他传统胶原纤维特染方法,胶原纤维与心肌组织着色鲜亮、颜色对比明显、稳定性佳、方便快捷,更适用于后续胶原纤维占比定量分析应用.

背景:前期研究显示,改良津下缝合法可用于修复鸡肌腱损伤,由于未进行修复后的功能锻炼,使得肌腱出现较明显的粘连,体现了肌腱修复术后进行功能锻炼的重要性.目的:探讨预防改良津下缝合法修复鸡屈趾肌腱断裂模型肌腱粘连被动功能锻炼的方案.方法:取10月龄三黄鸡100只,建立右足第三趾Ⅱ区趾深屈肌腱断裂模型后,采用随机数字表法分为5组,每组20只:A组术后石膏固定3周,并且每天给予1次的被动功能锻炼,连续3周;B组术后石膏固定3周,并且每天给予2次的被动功能锻炼,连续3周;C组术后石膏固定3周,并且每天给予3次的被动功能锻炼,连续3周;D组术后石膏固定3周;E组不进行石膏固定也不进行被动功能锻炼.3周后,观察鸡爪的大体形态、肌腱吻合端的形态及腱周粘连程度,检测第三趾屈趾深肌腱滑移距离和所有关节的屈曲角度、肌腱吻合端病理形态和羟脯氨酸含量.结果与结论:①E组肌腱在术后6 d左右完全断裂,从实验中剔除;B、C组鸡爪有较好的抓握形态,D组鸡爪几乎无抓握形态,A组鸡爪抓握形态差于B、C组;②B、C组肌腱吻合端膨大不明显,质地和正常腱性组织差别不大,相对于C组,B组肌腱粘连程度相对轻;D组肌腱吻合端膨大明显,质地较硬,腱周组织瘢痕明显,粘连程度重;A组的表现介于B、C组和D组之间;③B、C组鸡第三趾屈趾深肌腱滑移距离和所有关节的屈曲角度均优于A、D组(P<0.05),B组鸡肌腱中羟脯氨酸含量高于A、C、D组(P<0.05);④苏木精-伊红与天狼星红染色显示,A、C、B组肌腱胶原纤维排列逐渐有方向性,鲜红粗大的Ⅰ型胶原纤维逐渐增多,绿色细小的Ⅲ型胶原纤维逐渐减少;E组肌腱胶原纤维排列方向性差,Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维交叉分布;⑤结果表明,改良津下缝合法修复鸡屈趾肌腱断裂模型术后,每天2次充分的被动功能锻炼既能有效减轻肌腱粘连又能减少肌腱断裂的发生.

目的 探讨PCSK9对小鼠肝脏脂肪变性的机制.方法 以腺相关病毒8.2(adeno-associated virus 8.2,AAV8.2)为载体构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和人源PCSK9经尾静脉转染至小鼠肝脏表达.将36只C57BL/6J小鼠按照随机数字表法分为空白组、GFP组和PCSK9组,每组各12只,共饲养24周.通过苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色观察肝脏组织形态,天狼星红染色(sirius red staining,SRS)观察肝脏纤维化程度,油红0(oil red O,ORO)染色观察肝脏脂质浸润程度.通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清PCSK9、白细胞介素(interleukin,IL)-1β,流式细胞术检测肝脏单核细胞胞内炎性细胞因子,包括IL-2、IL-4、γ-干扰素(interferon-γ,INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、颗粒酶B(granulase B,GrB).免疫组化检测肝组织巨噬细胞标志物CD68阳性细胞百分比.Western blot法检测PCSK9干预小鼠单核-吞噬细胞白血病细胞(RAW264.7)细胞胆固醇流出蛋白、清道夫受体相关蛋白、NF-κB信号通路相关蛋白表达.结果 PCSK9组小鼠肝脏组织脂滴总量、脂肪变性、空泡化、纤维化程度明显增加或增强(P＜0.001).免疫组化检测结果显示,PCSK9组巨噬细胞标志物CD68阳性细胞百分比显著高于GFP组及空白组(P＜0.05).流式细胞术检测结果显示,PCSK9组IL-2、TNF-α在CD4+、CD8+细胞亚群百分比明显高于高脂GFP组(P＜0.05),而IL-4、INF-γ,GrB在组间各细胞群中比较,差异无统计学意义(P＞0.05).Western blot法检测结果显示,与空白组比较,PCSK9显著降低LDLR水平,升高 ATP 结合盒转运体 A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、清道夫受体 B(scavenger receptor B,SRB 或 CD36)、Toll样受体 4(Toll-like receptor 4,TLR4)、磷酸化 IκBα 激酶(phosphorylated inhibit kappa B α kinase,p-IκBα)、磷酸化 p65 蛋白(phosphorylated p65,p-p65)蛋白水平(P＜0.05).结论 PCSK9介导NF-κB信号通路致小鼠肝脏脂肪代谢失衡及炎性细胞因子浸润加速了肝脏脂肪变性.

目的 应用实时超声弹性成像技术,观察不同消融功率致兔骨骼肌损伤后肌肉组织弹性的自然恢复情况.方法 44只新西兰大白兔,其中4只作为正常对照(正常组),余40只随机分为2组:30 W组和50 W组,分别在高频超声引导下用2450 MHz的微波消融仪(KY-2100型)启动30 W或50 W功率微波热凝右侧股内侧肌肉3 min.分别于消融后1 h、1 d、2 d、7 d、28 d时行超声弹性成像检查,计算消融区弹性应变率(SR);并于每个时间点切取30 W和50 W组兔右侧股内侧热凝固化肌肉组织与正常组兔同侧相同区域肌肉组织,进行病理组织学观察.结果 30 W和50 W组兔骨骼肌消融区以蓝色为主,消融后7 d可见以蓝色为主的消融区内出现较多绿色,而在消融后28 d时50 W组消融区比30 W组仍有更多蓝色.与正常组比较,消融后1 h、1 d、2 d,30 W和50 W组兔骨骼肌消融区SR均增高,差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01);消融后7 d、28 d,两组兔骨骼肌消融区SR逐渐降低,但两组在消融后7 d时SR仍高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01),而在28 d时仅50 W组与正常组相比差异有统计学意义(P<0.01),30 W组SR与对照组相近(P>0.05).H-E染色结果显示,30 W和50 W组兔骨骼肌消融区有不同程度组织损伤、碳化、周边肌纤维凝固性坏死.消融后1～2 d消融区中心与边缘交界处可见炎症细胞浸润,50 W组巨噬细胞较30 W组增加更多;消融后7～28 d时30 W和50 W组交界处可见大量新生血管和成纤维细胞及瘢痕形成,炎症、浊肿等减轻.Masson染色结果显示,消融后1 h时,30 W和50 W组兔骨骼肌纤维含量较少,无明显纤维增生,消融后1～2 d交界处可见不同程度新生胶原纤维,肌间质纤维增生;消融后7～28 d交界处可见明显大量新生胶原纤维并伴随血管壁周边纤维明显增多.天狼星红染色结果显示,消融后30 W和50 W组交界处可见逐渐增生的新生胶原纤维修复损伤区.消融后1 h和1 d时两组主要为Ⅰ型胶原纤维;消融后2 d时不仅有Ⅰ型胶原纤维,还开始出现Ⅱ型胶原纤维;消融后7 d和28 d时可见较多Ⅱ型胶原纤维呈网状分布.结论 不同功率微波消融可致兔骨骼肌急性损伤,在消融后1～2 d进行性加重,消融后7～28 d呈修复趋势,50 W组修复晚于30 W组.实时超声弹性成像与病理组织学的再生纤维化趋势改变较为一致,可动态、无创评估肌肉损伤修复不同时期相应组织的弹性变化,从而间接反映骨骼肌的损伤后修复过程,是常规超声检查的有益补充.

目的:采用α-萘异硫氰酸酯(ANIT)多次灌胃给药制备慢性胆汁淤积肝纤维化大鼠模型,观察绿原酸对该模型胆管及胶原增生的影响,探讨其防治机制.方法:健康成年SPF级Wistar雄性大鼠40只,随机分为5组:对照组、模型组、熊去氧胆酸(UDCA)组、绿原酸低剂量组和绿原酸高剂量组,每组8只.除对照组外,其余4组均以ANIT(80 mg/kg)灌胃5周、每周3次,制备慢性胆汁淤积模型,同时UDCA组、绿原酸低剂量组和绿原酸高剂量组,分别给予UDCA(90 mg/Kg)、绿原酸(50 mg/Kg和100 mg/Kg)灌胃,每日1次,连续5周.治疗5周结束后,连同对照组、模型组,共5组动物,麻醉状态下,经腹主动脉取血,全自动生化分析仪检测血清中总胆红素(TBIL)、结合胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)以及碱性磷酸酶(ALP)水平.切取部分肝组织,中性甲醛固定,进行HE染色、天狼星红染色,观察评价肝组织胆汁淤积、胆管增生及胶原增生等病理改变情况;另取部分肝组织,匀浆提取总蛋白,Western blot法检测肝星状细胞活化标志分子-α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平.结果:与正常组比,模型组大鼠血清TBIL、DBIL、IBIL、ALP水平显著升高(均P<0.01);与模型组比,绿原酸高、低剂量组以及UDCA组血清TBIL、DBIL、IBIL水平显著降低(P<0.05),ALP有下降趋势,但差异无显著性(P>0.05).模型组HE染色显示肝组织慢性炎性细胞浸润明显,汇管区胆管增生、扩张显著;绿原酸高、低剂量组及UDCA组肝慢性炎性反应及汇管区胆管增生反应显著减轻.天狼星红染色显示正常组大鼠肝组织胶原表达稀少,而模型组汇管区胶原表达显著增强,偏振光下以亮红黄色的I型胶原为主;与模型组比,绿原酸高、低剂量组以及UDCA组肝组织胶原染色均显著减轻,偏振光下以呈绿色的Ⅲ型胶原为主.Western blot法检测显示,模型组大鼠肝组织中α-SMA表达水平显著升高(P<0.01),与模型组比,绿原酸高、低剂量组以及UDCA组肝组织α-SMA表达显著降低(均P<0.05).结论:绿原酸可显著改善慢性胆汁淤积大鼠模型的肝功能损伤、有效抑制肝星状细胞活化、减少以I型胶原为主的胶原产生、减轻慢性胆汁淤积所致的汇管区胆管增生,从而发挥抗肝纤维化作用.

目的 探讨不同特殊染色方法对关节软骨组织形态显示的效果比较.方法 选取肩袖修复术后8周的兔8只,截取双肩关节,行纵切面切开后固定、脱钙、石蜡包埋,切片,分别行改良Harris′苏木精-伊红染色、番红O固绿染色、苦味酸天狼星红染色、改良Masson染色、爱尔新兰(pH 25)-高碘酸-无色品红法(AB-PAS)染色,观察兔肩关节软骨组织形态学变化并进行方法学比较.结果 改良Harris′苏木精-伊红染色缺乏组织特异性,并不能清晰反映软骨的分层结构,可作初筛染色来选择;番红O固绿染色操作简便、颜色鲜艳、对比清晰,能全面反映软骨组织学信息;苦味酸天狼星红染色结构分层、颜色对比不明显,且需特殊设备,实用性和经济性不高;改良Masson染色操作步骤繁琐,费时,软骨在蓝染的情况下,软骨层的结构分层并不算十分明显,对比染色略逊于番红O固绿染色;AB-PAS染色操作繁琐,染色结果只能部分反映关节软骨的多糖蛋白分布,并未能显示软骨生长的全面信息.结论 番红O固绿染色可以获得更为全面的关节软骨形态学信息,对比清晰.