目的:研究褪黑素在体外培养中改善高龄卵巢功能减退女性颗粒细胞线粒体功能、减轻氧化应激状态的作用及可能机制。方法:收集在2022年3月至6月期间在郑州大学第二附属医院生殖医学中心接受辅助生殖技术助孕患者取卵后废弃的卵泡液，提取壁层颗粒细胞，按患者年龄分为高龄组（年龄≥38岁，6例）和年轻对照组（年龄<35岁，6例）。使用透射电子显微镜观察颗粒细胞的线粒体超微结构，通过ATP检测试剂盒检测细胞内ATP，实时荧光定量PCR检测线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数，JC-1荧光探针检测线粒体膜电位，MitoSOX? Red 线粒体氧化物指示剂检测活性氧含量，Western blotting法检测SIRT3、SOD2的蛋白表达。将高龄组的颗粒细胞样本根据随机数字表法分为褪黑素处理组和空白对照组（各5例），检测在体外培养颗粒细胞时添加褪黑素1 μmol/L后线粒体上述检测指标与空白对照组的差异。转染siRNA下调颗粒细胞内SIRT3，检测褪黑素添加前后上述检测指标并与阴性对照组比较。结果:高龄组颗粒细胞的线粒体超微结构与年轻对照组相比存在明显差异，线粒体结构显示不清，线粒体嵴少见且不规律排列，ATP水平（ P=0.012）、mtDNA拷贝数（ P=0.005）和线粒体膜电位（ P=0.009）显著低于年轻对照组，活性氧含量显著增加（ P=0.003），SIRT3和SOD2水平显著降低（ P<0.001和 P=0.002），差异均有统计学意义。经褪黑素体外培养后，线粒体超微结构有所恢复，ATP水平（ P<0.001）、mtDNA拷贝数（ P=0.038）和线粒体膜电位（ P=0.002）高于空白对照组，SIRT3和SOD2水平高于空白对照组（ P=0.011和 P=0.031），活性氧含量低于空白对照组（ P<0.001），差异均有统计学意义。siRNA转染后的颗粒细胞SIRT3的表达显著下调（ P<0.001）。经褪黑素处理后，细胞内ATP水平、mtDNA拷贝数和线粒体膜电位均低于未下调SIRT3的阴性对照组（ P<0.001、 P=0.001、 P<0.001），活性氧含量高于阴性对照组（ P<0.001），差异均有统计学意义。 结论:在体外培养中添加褪黑素可以改善高龄卵巢功能减退女性颗粒细胞的线粒体功能和氧化应激状态。褪黑素除了直接抗氧化作用，还可通过调节SIRT3和SOD2水平来降低活性氧含量。

背景:随着人口老龄化、医疗技术不断的更新,红细胞需求呈增加趋势,血液供应也日趋紧张.体外制备可供临床应用的血液制品成为众多专家关注的热点,而体外诱导造血干细胞向成熟红细胞分化是获得新型血源的可能途径之一.目的:探讨采用三阶段悬浮培养体系诱导外周血废弃白膜层来源造血干细胞向成熟红细胞分化及体外生产成熟红细胞的可行性.方法:经河南省红十字血液中心伦理委员会批准,采用外周血废弃白膜层为原料(献血者均知情同意),分离出CD34+细胞,以此为种子细胞,采用三阶段21 d悬浮培养体系体外诱导造血干细胞向成熟红细胞分化,分别在第4,7,9,11,13,15,17,19,21天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线,了解细胞生长情况;在第7, 11,15,19,21天进行细胞涂片和瑞氏-吉姆萨染色,显微镜下观察细胞形态学变化;在培养第7天时,采用流式细胞仪检测红系早期分化情况;在第7,11,15,17天时,采用流式细胞仪检测红系终末分化情况;在第15,17,19天时,采用流式细胞仪检测脱核率.结果与结论:①随着培养天数增加,细胞呈增加趋势,到第17天达高峰,细胞扩增约1 300倍,之后趋于平稳状态;②随着培养天数的增加,细胞从原幼红细胞向嗜碱性幼红细胞、多染幼红细胞、正染幼红细胞分化,培养至21 d时,几乎全部分化为脱核红细胞;③红系早期分化情况:IL-3R/GPA双阴性细胞占(15.8±0.21)%,其中红系爆发集落形成单位(BFU-E)占(0.98±0.21)%,红系祖细胞克隆形成单位(CFU-E)占(8.13±1.42)%;④红系终末分化情况:随着细胞培养天数的增加,GPA表达也逐渐增加,培养至第17天时,接近90%的细胞表达GPA,表明造血干细胞定向红系分化较为成功;⑤随着培养天数的增加,无核红细胞越来越多,至第19天80%以上均为无核红细胞;⑥结果表明,采用三阶段21 d悬浮培养体系,体外诱导来自废弃白膜层的外周血造血干细胞向成熟红细胞分化,可以生产成熟红细胞,且能达到较高脱核率.

背景:人羊膜间充质干细胞属于成体干细胞,其来自于废弃的胎盘,来源广泛,可以无创获取,具有免疫原性低、生长周期短等特点,是组织工程种子细胞的重要来源,目前人羊膜间充质干细胞已经用于临床糖尿病的治疗.目的:探索一种简便的方法构建人羊膜间充质干细胞膜片,并研究其成骨分化潜能.方法:将第3代人羊膜间充质干细胞高密度接种于普通培养皿中,加入成膜片诱导培养基以构建人羊膜间充质干细胞膜片,通过组织学染色以及扫描电镜观察细胞膜片的特性.取第3代人羊膜间充质干细胞高密度接种于培养皿中,加入成膜片诱导培养基培养7 d,再换用成骨诱导培养基培养14 d以构建成骨诱导的人羊膜间充质干细胞膜片.通过茜素红染色、免疫组化染色、碱性磷酸酶活性、RT-PCR以及Western blot检测人羊膜间充质干细胞膜片的成骨分化潜能.结果与结论:①苏木精-伊红染色可见人羊膜间充质干细胞膜片由多层细胞累积而成,细胞分布均匀;②扫描电镜观察可见人羊膜间充质干细胞膜片呈复层结构,胞外有大量的胞外基质产生,细胞包埋于胞外基质中;③人羊膜间充质干细胞膜片成骨诱导14 d,茜素红染色后可见橘红色沉淀,免疫组化染色后细胞周围有大量Ⅰ型胶原产生;④与未诱导的人羊膜间充质干细胞膜片相比,成骨诱导14 d后人羊膜间充质干细胞膜片碱性磷酸酶活性显著升高(P<0.01),Ⅰ型胶原、骨钙蛋白、Runt相关转录子2的mRNA和蛋白表达量显著升高(P<0.05);⑤该实验应用一种简便、经济的方法在普通培养皿上成功构建了人羊膜间充质干细胞膜片,体外研究证实人羊膜间充质干细胞膜片具有良好的成骨分化潜能.