无义介导的mRNA降解(NMD)是一种重要的真核生物mRNA质量监控途径.NMD可识别并降解含有提前终止密码子(PTC)的异常mRNA(PTC-mRNA).但NMD途径对PTC-mRNA的识别和降解机制尚无阐明.蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)是一种寄生性的原生动物,进化上处于真核生物基部,对其NMD途径的研究有利于了解NMD途径的机制与进化.本研究通过双分子荧光互补实验、酵母双杂交实验和体外pull-down实验,分析了贾第虫的UPF1 (GlUPF1)、SMG1 (GlSMG1)和肽链释放因子(GleRF1、GleRF3)之间的相互作用关系.结果表明,贾第虫的肽链释放因子都能够与GlUPF1发生相互作用,且GlUPF1的CH结构域与GleRF3能够形成较稳定的复合体,而GlSMG1的激酶结构域PIKK能与UPF1的C端和N端结构域相互作用.进一步研究证实,GlSMG1的PIKK结构域能使GlUPF1两种截短体GlUPF1(1～500 aa)和GlUPF1(501 ～1 304 aa)发生磷酸化修饰,说明GlUPF1的N端和C端均有GlSMG1的磷酸化位点.进一步分析证实,T111是GlUPF1上的1个磷酸化位点.我们的研究结果表明,贾第虫NMD途径起始阶段,首先在mRNA的PTC处的核糖体上形成SMG1-UPF1-eRF1-eRF3 (SURF)复合体,并且GlSMG1磷酸化修饰GlUPF1,由此激活NMD途径,可能招募XRN1和SKI7d等酶参与无义mRNA的降解.

无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是一种重要的mRNA质量监测机制,可以识别和降解含有提前终止密码子(premature termination codons,PTCs)的异常转录本,但其详细的分子机制还没有完全阐释清楚.纤毛虫是真核生物进化最早的一个分支,对其NMD途径的研究有助于阐明高等生物基因表达调控的进化与分子机制.该研究从纤毛虫八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)基因组中鉴定并克隆得到NMD因子EuUPF1、EuUPF2、Eu Y14a、EuY14b和EuMA GO的基因.酵母双杂交和体外pull-down实验分析证实了各因子间的相互作用关系:EuUPF1的CH结构域与EuUPF2的C-端结构域相互作用;Y14的两个同源体(paralogs)EuY14a和EuY 14b,作为mRNA结合蛋白,均与EuMAGO发生相互作用,形成真核生物mRNA外显子连接复合体(exon-exon junction complex,EJC)的核心.一方面,EuUPF1的CH结构域与EuY14a直接相互作用,结合到异常mRNA上;另一方面,EuUPF1可以通过EuUPF2与EuMAGO相互作用,后者再与EuY 14a和EuY 14b相互作用,把EuUPF1锚定到异常mRNA上.总之,EuUPF1通过两种方式结合在mRNA上,招募各种核酸酶,降解异常的mRNA.因为游仆虫基因组中内含子含量低于高等真核生物,而又远高于酵母真菌,因此研究者认为,依赖EJC和不依赖EJC的两种NMD途径可能共存于游仆虫细胞中,但这两种NMD途径具体的分子机制有待深入研究.

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作为细胞内的一种重要的mRNA质量监控机制,可以降解含有提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的异常转录本,从而避免截短蛋白质对细胞的毒害,但其详细的分子机制有待进一步阐释.蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)作为一种寄生性单细胞原生动物,进化地位特殊,对其NMD途径的研究有利于阐明基因表达调控的分子和进化机制.本研究通过酵母双杂交及体外pull-down实验分析了贾第虫NMD途径因子上游移码蛋白1(Giardia lamblia up-frameshift 1,GlUPF1)、贾第虫RNA结合蛋白(Giardia lamblia HRP1,GlHRP1)、贾第虫核糖核酸外切酶(Giardia lamblia Ski7p,GlSki7p、Giardia lamblia XRN1,GlXRN1)之间的相互作用关系.结果表明,GlUPF1全长与GlHRP1、GlXRN1(1～500aa)、GlSki7p间均可发生相互作用.而且GlUPF1的CH结构域和C端结构域分别与GlHRP1、GlXRN1 (1～500 aa)、GlSki7p相互作用.说明GlUPF1在贾第虫NMD途径中作为招募平台,在无义mRNA识别和降解过程中发挥重要作用.为此,结合本实验室之前的研究结果,我们提出原生动物贾第虫的NMD途径:在提前终止密码子处SURF(SMG1-UPF1-eRF1-eRF3)复合物形成后,GlUPF1被磷脂酰肌醇3-激酶(suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1,SMG1)磷酸化修饰,NMD途径激活,随后GlUPF1与HRP1相互作用,将转录本标记为NMD底物;GlUPF1进而招募下游贾第虫5'-3'核糖核酸降解酶GlXRN1、贾第虫3'-5'核糖核酸降解因子GlSki7p,最终降解靶标mRNA.

“遗传补偿效应”(genetic compensation response,GCR)是近年来在斑马鱼(Danio rerio)中最先描述的一个遗传现象,是指当敲低某一个基因时有明显的表型,但此基因的敲除遗传突变体由于其他基因的上调反而没有表型.这种基因敲低和敲除表型上的差异并非斑马鱼所独有,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小鼠(Mus musculus)等模式生物中都观察到此种现象.这种奇怪的现象一直困扰着基因功能研究.2019年4月3日,Nature同时在线发表两篇论文揭示了其中的奥秘,其中一篇来自于本实验室,另一篇来自于德国Stainier实验室.利用斑马鱼或小鼠培养细胞的不同基因的遗传突变体为模型,两个实验室分别证明无义突变与核酸序列同源性是激活遗传补偿效应的两个先决条件;无义mRNA介导的降解途径参与激活遗传补偿效应;同时还观察到补偿基因的高表达与其转录起始位点处的组蛋白H3K4me3修饰相关.本文具体介绍了这两篇研究论文中提出的“遗传补偿效应”分子机制的异同,以期为克服遗传补偿效应给基因功能研究带来的障碍提供新的思路和方法.

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)是一种mRNA质量监控机制,识别和降解含有提前终止密码子(premature termination codons,PTCs)的异常转录本,以保障基因的准确表达.到目前为止,有报道的从高等哺乳动物到果蝇、线虫、酵母和原生动物中,均有NMD调控途径,但其机制模型存在一定的差异.由于原生动物在生物的起源与进化上的特殊地位,以及所含的调控因子相对简单,在各种分子机制的研究领域成为热点材料.本文以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)作为研究对象,从八肋游仆虫大核基因组数据库中,经过同源序列比对,分析鉴定到参与NMD途径的相关因子,包括无义mRNA识别因子poly(A)结合蛋白(poly(A)binding protein,PABP);启动NMD途径的核心因子上游移码蛋白1(up-frameshift 1,UPF1)和上游移码蛋白2(up-frameshift 2,UPF2);外显子连接复合体(exon junction complex,EJC)组分因子MAGO(Mago nashi)、Y14(Tsunagi或RMB8)、eIF4AⅢ(eukaryotic initiation factor 4A3)和UAP56(U2AF56 associated protein 56);降解无义mRNA的相关因子外切体(exosome)、脱帽酶(decapping mRNA 2,DCP2)、外切酶(5'-3'exoribonuclease 1,XRN1)和去腺苷酸化酶(PGK promoter directed over production,POP2).其中,后3种蛋白质是mRNA加工小体(processing body,P-Body)的组分.通过荧光共定位分析,分别依次证实UPF1与UPF2之间、EJC组分因子之间和P-body组分因子之间的相互作用关系.随后,通过UPF2分别与MAGO和Y14的荧光共定位结果,推测八肋游仆虫依赖于EJC的NMD途径模型.通过UPF1分别与DCP2和外切体(exosome)的荧光共定位结果,推测了八肋游仆虫无义mRNA的两种降解方式:一种是无义mRNA被介导到P-body中分别被DCP2和POP2脱去5'端帽和3'端Poly(A)尾,随后在XRN1的作用下,沿着5'→3'的方向降解;另一种是在胞质中,无义mRNA直接通过招募POP2去腺苷酸化,随后又在招募来的外切体作用下,沿着3'→5'的方向降解.