目的:观察树突表达特异性7跨膜蛋白(DCSTAMP)对甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并探讨其机制。方法:在基因表达谱交互式分析平台(GEPIA)中分析DCSTAMP在甲状腺乳头状癌组织中的表达；采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测甲状腺乳头状癌细胞系KTC-1、FTC-133及甲状腺正常细胞Nthy-ori 3-1中DCSTAMP表达的差异；在KTC-1和FTC-133细胞中分别转染过表达和敲低质粒及其对照，构建DCSTAMP过表达和敲低细胞模型；过表达组通过细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8)、5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖检测试剂盒检测DCSTAMP基因过表达后对增殖的影响；蛋白印迹法验证过表达后对细胞核增殖抗原(Ki-67)蛋白、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影响；敲低组通过细胞划痕、侵袭测定实验(Transwell)实验检测DCSTAMP基因敲低后对迁移、侵袭的影响；蛋白印迹法验证敲低后对神经钙黏着蛋白(NCAD)、磷酸化蛋白激酶B蛋白(p-Akt)、总蛋白激酶B蛋白(t-Akt)表达的影响；两样本均数比较采用成组配对 t检验分析。 结果:RT-qPCR和Western blot结果均显示DCSTAMP基因在甲状腺乳头状癌细胞KTC-1、FTC-133中的表达高于甲状腺正常细胞Nthy-ori 3-1(RT-qPCR：DCSTAMP基因在Nthy-ori 3-1、KTC-1、FTC-133细胞中mRNA相对表达量分别为1.020±0.202、17.350±3.326、8.684±0.030，Nthy-ori 3-1与KTC-1比较： t＝4.901， P<0.05；Nthy-ori 3-1与FTC-133比较： t＝37.460， P<0.01；Western blot：DCSTAMP基因在Nthy-ori 3-1、KTC-1、FTC-133细胞中蛋白相对表达量分别为1.000±0.009、3.227±0.444、3.367±0.073，Nthy-ori 3-1与KTC-1比较： t＝9.628， P<0.01；Nthy-ori 3-1与FTC-133比较： t＝55.580， P<0.01)；KTC-1、FTC-133细胞中DCSTAMP过表达组细胞增殖速度高于对照组(KTC-1对照组与过表达组第3天相对增殖速度：0.215±0.010：0.397±0.029， t＝6.198， P<0.01；FTC-133对照组与过表达组第3天相对增殖速度：0.350±0.364：0.432±0.025， t＝33.640， P<0.01)，过表达组增殖能力高于对照组[KTC-1对照组比过表达组：(8.382±1.400)%比(91.253±1.699)%， t＝65.220， P<0.01；FTC-133对照组与过表达组：(14.385±2.441)%比(91.332±1.159)%， t＝49.320， P<0.01]，过表达组Ki-67表达高于对照组(KTC-1对照组与过表达组蛋白相对表达量：1.000±0.038比1.282±0.134， t＝9.968， P<0.01；FTC-133对照组与过表达组蛋白相对表达量：1.000±0.011比1.382±0.221， t＝40.920， P<0.01)，过表达组MAPK表达高于对照组(KTC-1对照组与过表达组：1.000±0.012比1.088±0.057， t＝10.720， P<0.01；FTC-133对照组与过表达组：1.000±0.039比1.220±0.123， t＝9.404， P<0.01)，过表达组MAPK通路亚家族细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达高于对照组：(1.000±0.005比7.047±0.088， t＝68.650， P<0.01；FTC-133对照组与过表达组：1.000±0.003比1.983±0.029， t＝34.000， P<0.01)；而在KTC-1、FTC-133中敲低DCSTAMP基因后，对照组细胞迁移速度高于敲低组(KTC-1对照组与敲低组：(72.545±0.704)%比(45.016±2.156)%， t＝21.020， P<0.01；FTC-133对照组与敲低组：(82.422±0.196)%比(49.824±5.402)%， t＝10.450， P<0.01)，对照组侵袭能力高于敲低组(KTC-1对照组与敲低组：(320.667±13.013)%比(172.333±11.240)%， t＝14.940， P<0.01；FTC-133对照组与敲低组侵袭细胞数：302.667±24.111比228.000±14.422， t＝4.603， P<0.01)，p-Akt表达对照组高于敲低组(KTC-1对照组与敲低组：1.000±0.029比0.376±0.355， t＝21.980， P<0.01；FTC-133对照组与敲低组：1.000±0.010比0.809±0.110， t＝35.900， P<0.01)。 结论:DCSTAMP基因通过激活MAPK通路亚家族ERK及Akt磷酸化在甲状腺乳头状癌细胞系中可以促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

目的:构建双层含骨基质骨器官芯片并用于体外模拟成骨细胞和破骨细胞分化，为抗骨质疏松药物开发提供新平台。方法:使用WorkSoild软件制作双层双通道骨器官芯片设计图，利用光刻技术制备浇注母版。以聚二甲基硅氧烷（PDMS）为原料，通过模具浇注制备芯片主体。以牛皮质骨片为间隔，分隔培养室4个通道进出口采用储液柱封闭。芯片验证实验分为成骨、破骨诱导组和成骨、破骨对照组，成骨、破骨诱导组将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1和小鼠巨噬细胞RAW264.7分别接种于芯片上，成骨诱导14 d，破骨诱导7 d。成骨、破骨对照组为不进行诱导的MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞。观察指标包括：（1）芯片外观及密封性：芯片制备完成后拍照观察外观并通过密封实验观察密封性能。（2）生物相容性：MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞接种于芯片培养3 d及培养1、3、5 d后，分别采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶（AM/PI）染色和细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）实验观察细胞存活情况。（3）成骨分化情况：对成骨诱导组细胞进行碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色观察成骨细胞诱导情况。收集成骨诱导组和成骨对照组细胞RNA，qPCR检测成骨细胞标志基因Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原（COL1A1）表达情况，观察成骨细胞分化程度和成骨能力。（4）破骨分化情况：对破骨诱导组细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞分化情况。提取破骨诱导组和破骨对照组细胞RNA进行破骨分化基因qPCR，检测破骨细胞标志基因TRAP、组织蛋白酶K（CTSK）和树突状细胞特异性跨膜蛋白（DC-STAMP）表达水平。结果:双层含骨基质骨器官芯片大小为3 cm×3 cm，整体透光，芯片系统结构对接紧凑，无渗液。钙黄绿素AM/PI染色结果显示，MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养3 d后，呈红色荧光死细胞极少。CCK-8实验结果显示，MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞培养5 d内，细胞活力均在90%以上，表明芯片生物相容性好，细胞可以正常存活并增殖。ALP染色和茜素红染色结果显示，成骨诱导14 d，成骨诱导组MC3T3-E1细胞成功分化为成骨细胞并产生钙化结节。qPCR结果显示，成骨诱导组MC3T3-E1细胞的RUNX2相对表达量为4.98±0.74，显著高于对照组的0.99±0.03（ P<0.01）；MC3T3-E1细胞的OCN相对表达量为7.98±0.76，显著高于对照组的1.00±0.06（ P<0.01）；MC3T3-E1细胞的COL1A1相对表达量为7.07±0.56，显著高于对照组的0.97±0.03（ P<0.01）。TRAP染色结果显示，破骨诱导7 d，破骨诱导组RAW264.7细胞形成巨大的多核破骨细胞，破骨细胞表达大量TRAP蛋白。qPCR检测结果显示，破骨诱导组RAW264.7细胞的TRAP相对表达量为3.35±0.37，显著高于对照组的1.01±0.06（ P<0.01）；RAW264.7细胞的CTSK相对表达量为3.46±0.79，显著高于对照组的1.01±0.05（ P<0.01）；RAW264.7细胞的DC-STAMP相对表达量为1.92±0.12，显著高于对照组的0.98±0.08（ P<0.01）。 结论:双层含骨基质骨器官芯片结构紧凑，可长期体外培养，生物相容性好，可进行成骨和破骨细胞分化诱导，有望为骨质疏松机制探究和药物筛选提供新的研究平台。

目的 研究白花蛇舌草-半枝莲药对乙酸乙酯组分(YDW11)对破骨细胞分化的抑制作用.方法 UPLC-MS法鉴定YDW11中化学成分后,MTT法分析其对RAW264.7细胞活力的影响.100 ng/mL核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)诱导RAW264.7细胞7d以建立破骨细胞模型后,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色考察TRAP阳性多核细胞数,相应试剂盒测定TRAP酶活性.QRT-PCR检测TRAP、树突状细胞-特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)、活化T细胞核因子cl(NFATc1)基因表达,Western blotting检测核因子κB受体活化因子(RANK)、肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)、NFATc1、组织蛋白酶K蛋白表达,Taqman MicroRNA RT-PCR检测miR-155表达.结果 YDW11中有16种成分,鉴定出对羟基苯乙酮、野黄芩苷、木犀草素、芹菜素.与模型组比较,YDW11组(25、50 μg/mL)阳性多核细胞数显著减少(P＜0.01),并对细胞活力无明显影响(P＞0.05);呈剂量依赖性地显著抑制酶活性,TRAP、DC-STAMP、NFATc1基因表达,RANK、TRAF6、NFATc1、组织蛋白酶K蛋白表达(P＜0.05),并显著提高miR-155表达(P＜0.05).结论 YDW11可通过上调miR-155表达、下调相关基因和蛋白表达抑制RANKL诱导的破骨细胞分化.

目的 克隆、表达细粒棘球绦虫磷酸甘油酸变位酶(EgPGAM),分析其免疫反应性及其在原头节、包囊及成虫中的分布情况,对EgPGAM的诊断价值进行初步评价. 方法 提取细粒棘球蚴原头节RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增EgPGAM基因,测序.通过多种生物信息学软件分析EgPGAM的理化性质、保守结构域、抗原表位和同源性等.利用Mega 5.0软件进行序列特征分析,采用邻接法构建系统进化树.将EgPGAM基因连接至pET32a表达载体,转入大肠埃希菌(E.coli)BL21 (DE3)中进行诱导表达,镍柱纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达情况并进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析.免疫荧光定位分析EgPGAM在原头节、包囊及成虫中的分布.采用ELISA评价EgPGAM的诊断价值. 结果 EgPGAM长756 bp,共编码251个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量(Mr)约28 000,等电点为8.29,不含信号肽,无跨膜区.EgPGAM含有12个高保守的氨基酸位点、3个保守的催化活性位点、1个底物结合位点和7个B抗原表位.EgPGAM的氨基酸序列与多房棘球绦虫、猪带绦虫、华支睾吸虫、秀丽隐杆线虫、人和羊的PGAM序列相似性分别为99％、94％、78％、45％、57％和4％.SDS-PAGE分析结果显示,EgPGAM在E.coli BL21 (DE3)中大量表达,主要以可溶形式存在;Western blotting分析结果显示,EgPGAM可与感染细粒棘球蚴的绵羊血清发生反应.免疫荧光定位显示,EgPGAM主要分布在原头节表皮层和顶突沟,包囊生发层和成虫薄壁组织.建立的间接ELISA敏感性为55.6％ (15/27),特异性为86.4％ (89/103). 结论 EgPGAM广泛分布于细粒棘球蚴和细粒棘球绦虫中,具有较好免疫反应性,但敏感性较低,不适合作为细粒棘球蚴病的候选诊断抗原.

目的 探讨树突表达特异性7跨膜蛋白(TM7SF4)在胶质母细胞瘤(GBM)中的表达及对增殖、凋亡、肿瘤免疫浸润等生物学功能的影响.方法 采用CCK8、流式细胞术、划痕实验、荧光定量PCR(RT-qPCR)分析TM7SF4在GBM中的表达和作用.采用生物信息学分析(包括TIMER、LinkedOmics、DAVID、String、TISIDB和cBio-Portal数据库分析)TM7SF4基因的表达、相关差异基因、基因富集和功能分析、免疫细胞浸润等.结果 TM7SF4在GBM组织和细胞系中低表达,差异有统计学意义(P＜0.01);在GBM细胞U251中干扰TM7SF4基因促进细胞增殖和迁移,抑制细胞凋亡,差异有统计学意义(P＜0.01);生物信息学分析TM7SF4表达相关基因主要参与免疫反应和细胞间信号传导等生物过程;TM7SF4的表达与GBM肿瘤免疫浸润B淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞的表达丰度均呈正相关(P＜0.05);TM7SF4基因可能与CCR7、CD80、GZMB、CSF2、CD27、CCL4、CD2、CD1C等基因存在相互作用关系.结论 TM7SF4在GBM中低表达,干扰TM7SF4能促进GBM细胞增殖和迁移和抑制细胞凋亡,TM7SF4可能是一个潜在的预后生物标志物和免疫治疗靶点.

目的:探讨吴茱萸碱对破骨细胞分化与骨吸收功能的调控及对骨质疏松症的治疗作用。方法:取小鼠原代骨髓来源巨噬细胞分别给予0、10、20、50、100、200 μmol/L吴茱萸碱处理，CCK8检测细胞活力；然后利用原代骨髓来源巨噬细胞给予小鼠重组可溶性核因子κB受体活化因子配体与集落刺激因子行破骨细胞分化诱导，分别给予20与50 μmol/L吴茱萸碱干预。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测破骨细胞形成能力，荧光定量PCR分析破骨细胞分化相关基因表达，免疫荧光检测F肌动蛋白（F-actin）形成，扫描电镜观察破骨细胞骨吸收能力。7月龄C57BL/6小鼠灌胃给予100与200 mg/kg吴茱萸碱，给药3个月后Micro-CT检测小鼠骨密度与骨质量。采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析。结果:CCK8结果显示，与对照组相比，给予10、20、50、100 μmol/L吴茱萸碱处理后细胞活力无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）；而给予200 μmol/L吴茱萸碱的细胞活力下降（100.64±0.18比47.54±5.58），差异具有统计学意义（P < 0.01）。与对照组相比，20 μmol/L吴茱萸碱的TRAP染色阳性细胞数[（200.57±28.35）比（142.29±19.21）个]、Trap （1.00±0.13比0.55±0.16）、组织蛋白酶K（Ctsk） （1.01±0.17比0.59±0.11）mRNA水平、骨吸收面积比（1.00±0.15比0.79±0.19）均减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。与对照组相比，50 μmol/L吴茱萸碱的TRAP阳性细胞数[（200.57±28.35）比（112.71±12.18）个]、Trap （1.00±0.13比0.46±0.17）、Ctsk（1.01±0.17比0.49±0.12）、树突状细胞-特异性跨膜蛋白（DC- Stamp） （1.00±0.10比0.55±0.14）、c-Fos （1.01±0.10比0.58±0.14）、活化T细胞核因子c1 （Nfatc1） （1.00±0.10比0.59±0.14）、H+转运ATP酶v0亚基d2 （Atp6v0d2）的mRNA表达（1.00±0.10比0.59±0.18）、F-actin数量[（165.00± 18.50）比（98.33±21.15）个]和骨吸收面积比（1.00±0.15比0.62±0.10）均降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。Micro-CT结果显示，与生理盐水组相比，100 mg/kg吴茱萸碱组小鼠骨密度有一定升高[（0.19±0.03）比（0.21±0.01）g/cm3]，但差异无统计学意义（P > 0.05）；与生理盐水组相比，200 mg/kg吴茱萸碱组小鼠胫骨的骨密度[（0.19±0.03）比（0.23±0.01）g/cm3]、骨体积比[（9.79±1.39）﹪比（11.62±1.18）﹪]、骨小梁数量[（2.43±0.29）比（3.08±0.43）/mm]上升，骨小梁分离度[（0.44±0.06）比（0.27±0.05）mm]下降，差异具有统计学意义（P < 0.05）。结论:吴茱萸碱通过抑制破骨细胞分化与骨吸收功能延缓小鼠骨量丢失。