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驽巴贝虫metacaspase基因的克隆、表达、反应原性鉴定和生物信息分析
编辑人员丨1个月前
目的 克隆、表达驽巴贝虫精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(BcMC),鉴定其反应原性并分析其生物学信息.方法 根据驽巴贝虫部分基因序列设计并合成Bcmc基因扩增引物,采用PCR扩增Bcmc基因并克隆至原核表达载体pET-28a,提取质粒pET-28a-Bcmc进行双酶切、PCR和测序鉴定,将重组质粒转入感受态细胞大肠埃希菌BL21(DE3),优化诱导条件后,选择最适异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导温度和时间诱导,采用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况.用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后,以驽巴贝虫感染阳性马血清为一抗,Western blotting分析重组蛋白的反应原性.采用ProtParam等生物信息学在线软件预测Bcmc基因的理化性质、磷酸化位点、亚细胞定位、抗原表位、二级和三级结构、蛋白互作网络,对比BcMC与疟原虫属MC-1(PsMC-1)和泰氏锥虫MC(TtMC)的三级结构.Bcmc序列在NCBI上进行BLAST比对,使用Mega 7.0软件,采用邻接法构建基于mc基因序列的系统进化树.结果 Bcmc基因PCR扩增产物约为996 bp,与预期片段一致.重组质粒pET-28a-Bcmc经双酶切、PCR和测序鉴定表明插入的目的基因正确.诱导条件优化结果显示,BcMC重组蛋白在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、37 ℃培养5 h时的表达量最高.SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体的形式表达,相对分子质量(Mr)约为36 000.Western blotting结果表明,纯化后的BcMC可与驽巴贝虫感染阳性马血清发生特异性反应.生物信息学分析结果显示,BcMC的Mr为36 956.72;具有25个磷酸化点位;亚细胞定位预测位于线粒体的比例为10％;B细胞抗原表位分析发现该蛋白含有12个潜在抗原表位;BcMC蛋白的二级结构中,无规则卷曲占50.30％、α-螺旋占23.19％;BcMC的三级结构与PsMC-1和TtMC相似;蛋白互作网络预测结果显示,与BcMC相互作用的蛋白及BcMC参与的生物过程均与细胞凋亡有关.BLAST比对结果和系统进化树分析结果显示,Bcmc与马泰勒虫(CP099439)、马泰勒虫WA株(XM_004830992)的mc基因序列一致性均为99.90％,进化树上聚为一支,亲源关系较近.结论 BcMC原核表达蛋白具有良好的反应原性,生物信息学分析表明BcMC参与驽巴贝虫凋亡的生物过程.
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编辑人员丨1个月前
