目的:获取具有生物活性的狂犬病病毒核蛋白在大肠埃希菌表达系统中高效表达。方法:实验使用密码子优化技术重新编码狂犬病病毒CTN-1株核蛋白基因，人工合成全长基因并克隆至pET-43.1a表达载体，在大肠埃希菌BL21(DE3)株中诱导表达，并使用Western blot检测其反应原性。结果:诱导后SDS-PAGE分析显示在相对分子质量50×10 3处出现明显的表达条带，与预期蛋白质条带大小一致。其中在大肠埃希菌 A600为0.5左右，37℃诱导5 h时表达产量最高(约为32.3%)。大量表达时核蛋白的表达形式主要为包涵体，后经Ni 2+螯合层析纯化，获得纯度为95%以上的目的蛋白。纯化产物经Western blot鉴定，与疫苗免疫小鼠血清呈阳性反应，表明大肠埃希菌表达CTN-1株核蛋白具有生物活性。 结论:本实验成功建立了CTN-1株核蛋白在大肠埃希菌表达系统的高效表达方法，并获得了高纯度目的蛋白，为进一步的临床诊断和新型疫苗制备提供基础资料。

目的:评价医用羧甲基葡糖胺聚糖凝胶的生物安全性。方法:采用鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验（Ames实验）、体外染色体畸变实验和体外基因突变实验检测医用羧甲基葡糖胺聚糖凝胶的遗传毒性。以日本大耳白兔为受试动物，经耳缘静脉缓缓注入凝胶盐水浸提液（10 ml/kg），测其体温并计算体温升温值。以昆明种小鼠为受试动物，分别经腹腔注射和尾静脉注射凝胶盐水浸提液（50 ml/kg）和氯化钠注射液（对照），观察动物的毒性反应，记录动物的体质量变化。在抗凝兔血中分别加入凝胶盐水浸提液、氯化钠注射液与蒸馏水，检测溶血率。结果:在活化和非活化条件下，凝胶盐水浸提液组和凝胶二甲基亚砜浸提液组4种菌株的回变菌落数均未达到相应阴性对照组的2倍；3个剂量组（凝胶培养基浸提液和1/2、1/4凝胶培养基浸提液组）中国仓鼠肺成纤维细胞的染色体畸变率均为0；3个剂量组小鼠淋巴瘤细胞L5178Y的大集落突变频率、小集落突变频率和总突变频率均无明显增长（均 P>0.05）。注射凝胶盐水浸提液后，3只日本大耳白兔的体温升温值分别为0、0.3和0.2 ℃。注射凝胶盐水浸提液后24、48和72 h，各组小鼠均未见毒性反应症状，且随着注射后时间的延长，样品组和对照组小鼠体质量均有所增长，但差异均无统计学意义（均 P>0.05）。溶血实验结果显示，医用羧甲基葡糖胺聚糖凝胶的溶血率为0.1%。 结论:医用羧甲基葡糖胺聚糖凝胶无诱发细菌突变、体外细胞染色体畸变及细胞基因突变的作用，亦无热原性、急性全身毒性和溶血性，表明其具有良好的生物安全性。

目的 克隆、表达驽巴贝虫精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(BcMC),鉴定其反应原性并分析其生物学信息.方法 根据驽巴贝虫部分基因序列设计并合成Bcmc基因扩增引物,采用PCR扩增Bcmc基因并克隆至原核表达载体pET-28a,提取质粒pET-28a-Bcmc进行双酶切、PCR和测序鉴定,将重组质粒转入感受态细胞大肠埃希菌BL21(DE3),优化诱导条件后,选择最适异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导温度和时间诱导,采用12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况.用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后,以驽巴贝虫感染阳性马血清为一抗,Western blotting分析重组蛋白的反应原性.采用ProtParam等生物信息学在线软件预测Bcmc基因的理化性质、磷酸化位点、亚细胞定位、抗原表位、二级和三级结构、蛋白互作网络,对比BcMC与疟原虫属MC-1(PsMC-1)和泰氏锥虫MC(TtMC)的三级结构.Bcmc序列在NCBI上进行BLAST比对,使用Mega 7.0软件,采用邻接法构建基于mc基因序列的系统进化树.结果 Bcmc基因PCR扩增产物约为996 bp,与预期片段一致.重组质粒pET-28a-Bcmc经双酶切、PCR和测序鉴定表明插入的目的基因正确.诱导条件优化结果显示,BcMC重组蛋白在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、37 ℃培养5 h时的表达量最高.SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体的形式表达,相对分子质量(Mr)约为36 000.Western blotting结果表明,纯化后的BcMC可与驽巴贝虫感染阳性马血清发生特异性反应.生物信息学分析结果显示,BcMC的Mr为36 956.72;具有25个磷酸化点位;亚细胞定位预测位于线粒体的比例为10％;B细胞抗原表位分析发现该蛋白含有12个潜在抗原表位;BcMC蛋白的二级结构中,无规则卷曲占50.30％、α-螺旋占23.19％;BcMC的三级结构与PsMC-1和TtMC相似;蛋白互作网络预测结果显示,与BcMC相互作用的蛋白及BcMC参与的生物过程均与细胞凋亡有关.BLAST比对结果和系统进化树分析结果显示,Bcmc与马泰勒虫(CP099439)、马泰勒虫WA株(XM_004830992)的mc基因序列一致性均为99.90％,进化树上聚为一支,亲源关系较近.结论 BcMC原核表达蛋白具有良好的反应原性,生物信息学分析表明BcMC参与驽巴贝虫凋亡的生物过程.

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础.方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1.分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3.通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测.结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2 000 bp的基因片段,与预期大小相符.昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52 000,与预期相符.WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应.结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件.

目的 制备狂犬病病毒(rabies virus,RV)基质蛋白(M)鼠源和兔源多克隆抗体,并比较其反应原性.方法 以RV CVS-11毒株感染细胞后的cDNA为模板构建原核表达载体pET-28a-M,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达M蛋白,经镍柱亲和层析、透析复性后,免疫雌性BALB/c小鼠和雌性新西兰大白兔,取全血,分离血清,ELISA法检测鼠源和兔源多克隆抗体效价,Western blot法、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)、免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)法检测鼠源和兔源多克隆抗体反应原性.结果 质粒pET-28a-M经测序鉴定证明构建正确;制备的鼠源和兔源多克隆抗体效价分别为1∶100和1∶256 000,与不同RV毒株均具有反应原性.结论 成功制备了 M蛋白鼠源和兔源多克隆抗体,为探讨M蛋白与宿主蛋白相互作用的关系以及研究RV的致病机制提供了重要的生物学工具.

[背景]鸭短喙侏儒综合征(beak atrophy and dwarfism syndrome,BADS)是由新型鸭细小病毒(novel duck Parvovirus,NDPV)感染导致雏鸭生长发育迟缓、上下喙萎缩的疾病.BADS的暴发给我国养鸭业造成了巨大的经济损失.[目的]利用大肠杆菌表达系统制备 NDPV 病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),为研制NDPV相关疫苗奠定基础.[方法]对NDPV VP2 序列全长进行密码子优化、合成,连接至pColdTF表达载体,获得pColdTF-NDPV-VP2 重组质粒,酶切、测序鉴定正确后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对蛋白表达进行可溶性分析;使用凝血酶(thrombin)切除trigger factor(TF)标签,利用镍柱(Ni-NTA)亲和层析方法纯化重组蛋白;利用Western blotting对纯化后的VP2 蛋白进行反应原性分析;利用透射电镜、动态光散射观察重组蛋白形态以及能否形成VLPs.[结果]构建了pColdTF-NDPV-VP2 重组质粒,在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达,融合蛋白TF-VP2 大小约为 115 kDa,去除TF标签经镍柱纯化后得到 67 kDa的VP2 蛋白;Western blotting试验表明VP2 蛋白能与NDPV鸭阳性血清发生特异性结合;通过透射电镜可以观察到形状规则、直径约为 20-25 nm的病毒样颗粒.[结论]利用大肠杆菌表达系统制备了NDPV VLPs,为下一步研发BADS相关亚单位疫苗及生物相关制品提供了基础.

目的 克隆表达屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Der p)第5组变应原Der p 5基因,在E.coli中表达、纯化重组Derp5蛋白,并分析其血清IgE反应原性.方法 以合成的Der p 5核酸序列为模板进行PCR扩增,产物经双酶切后与载体pCold-TFM连接,构建重组表达质粒pCold-TFM-Der p 5,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.用镍离子亲和层析柱和凝胶过滤层析柱纯化目的蛋白,尘螨过敏患者血清鉴定其IgE反应原性.结果 重组表达质粒pCold-TFM-Der p 5经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确;在E.coli BL21(DE3)中实现了目的蛋白的可溶性高表达,每升细菌表达产物经纯化可得到纯度95％以上的Der p 5蛋白约6 mg.纯化的重组Der p 5蛋白与尘螨过敏患者血清IgE有结合活性.结论 成功构建了Der p 5原核表达载体,高效表达并纯化了目的蛋白,纯化的重组Derp5蛋白具有良好的IgE反应原性,为屋尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及致敏蛋白的进一步研究奠定了基础.

目的 原核表达鸭坦布苏病毒(DTMUV)非结构蛋白1(NS1)蛋白,并制备小鼠抗NS1多克隆抗体.方法 利用PCR从DTMUV AH-F10株cDNA中获得NS1基因,亚克隆至pET-32a中进行原核表达,对表达产物进行鉴定.使用含尿素的Tris缓冲液洗去杂蛋白再梯度复性,纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备小鼠抗NS1多克隆抗体,琼脂扩散试验测定抗体效价,Western blot法鉴定该抗体的特异性与反应原性,将抗体应用于病毒的间接免疫荧光法(IFA)检测.结果 获得鼠抗NS1蛋白多克隆抗体,效价达到1∶8;Western blot结果表明该多抗血清具有良好的特异性和反应性,且可以应用于病毒的IFA检测.结论 成功制备了鼠抗NS1多克隆抗体.

构建H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)和HA蛋白颈部区(HA2)串联体,并在原核系统中进行该重组蛋白的表达,以便研究重组蛋白的反应原性.以含有全长H9N2亚型AIVHA基因的质粒为模板,经过PCR扩增得到HA2基因;利用Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ互为同尾酶的链接方法,构建3个拷贝M2e和HA2基因的串联体,并将串联体连接入原核表达载体pGEX-4T-1构成3M2e+HA2-pGEX重组质粒;同时构建单独表达HA2蛋白的原核表达重组质粒HA2-pGEX;DNA测序鉴定这两种重组质粒正确后,转化至表达宿主菌中;重组蛋白经不同IPTG浓度进行诱导;SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,并进行可溶性分析和纯化;采用Western blotting法对两种重组蛋白的反应原性进行分析.结果显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.5 mmol/L和0.25 mmol/L的IPTG诱导,37℃培养4h时,表达量最高;3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白大小分别为59.4 ku和49.8 ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,两种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blotting分析显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白与免疫H9N2禽流感病毒后获得的阳性血清具有良好的特异性反应,这些结果为进一步研究HA2、3M2e+HA2蛋白的免疫原性和开发广谱H9N2亚型禽流感疫苗提供了理论依据.

目的 原核表达并纯化十二指肠贾第虫α-6贾第素(α-6 Giardin).方法 以十二指肠贾第虫的cDNA为模板,PCR扩增α-6 Giardin基因片段,连接至pMD 18-T载体,得到重组克隆质粒pMD 18-T-α-6,将双酶切后得到的目的片段连接至pET-28a表达载体中,得到重组表达质粒pET-28a-α-6,转化至E coli Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达目的蛋白α-6 Giardin,收集菌体,离心后进行SDS-PAGE及Western blot鉴定,并利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合的α-6 Giardin蛋白.结果 质粒pET-28a-α-6经双酶切鉴定,证明构建正确;表达的目的蛋白α-6Giardin为带His标签的包涵体蛋白,相对分子质量约40 000,可与鼠抗His单抗特异性结合,具有良好的反应原性;纯化的重组d-6Giardin融合蛋白相对分子质量约40 000,纯度可达80％.结论 成功克隆、表达并纯化了十二指肠贾第虫α-6Giardin蛋白,为十二指肠贾第虫α-6 Giardin进一步的功能研究奠定了基础.