为探究动物园土壤中耐高温真菌的群落组成及其降解角蛋白的能力.本研究以我国 20 个动物园的土壤样品为对象,在温度为 40℃条件下,采用稀释平板法和形态学与系统学相结合的方法对动物园土壤中的耐高温真菌进行分离培养和鉴定,随后基于脱脂奶粉培养基和鸡羽毛发酵培养基对菌株进行降解角蛋白能力探究.结果表明,从动物园土壤中共分离获得耐高温真菌 3 399 株,隶属于 8 纲、9 目、15 科、39 属、60 种.在科水平,20 个动物园中曲霉科 Aspergillaceae 为优势科,曲霉科Aspergillaceae和毛壳科Chaetomiaceae为共有科.在属水平,曲霉属Aspergillus为所有样地的优势属和共有属.在种水平,黑曲霉A.niger为优势种.此外,本研究共获得 6属 10种 35株能降解角蛋白的耐高温真菌,其中顶瓶梗霉属Acrophialophora降解角蛋白的菌株最多,有3种15株;其次为曲霉属Aspergillus的3种11株.光滑顶瓶梗霉Acrophialophora levis QHDZ1-2菌株的降解率最高,达 52.90%.同时,顶瓶梗霉属Acrophialophora和嗜热疣霉属Thermothelomyces这 2 个属首次发现具有降解角蛋白能力.本研究将为进一步探究中国耐高温真菌群落组成、分布及其降解角蛋白菌株的开发利用奠定资源基础.

枯草芽孢杆菌UMU4和短小芽孢杆菌SCU11是四川省分子生物学及生物技术重点实验室分离的野生菌株经诱变获得的胞外蛋白酶高产菌株,其分泌的蛋白酶在蛋白废弃物处理方面具有良好的应用前景.为了从这两株芽孢杆菌中筛选出高效利用羽毛的最优菌株,将UMU4和SCU11分别接种到羽毛培养基中并持续发酵6d,通过每天测试羽毛降解率、可溶性多肽含量、氨基酸含量、蛋白酶活及抗氧化活性等指标来评价这两株菌对羽毛的降解能力.结果发现SCU11能更高效地利用羽毛,其羽毛降解率是UMU4的1.2倍,第5天时约有65％的羽毛转化为可溶性肽和氨基酸;SCU11发酵液的ABTS自由基清除率和还原力均在第3天达到最大值,且显著高于UMU4羽毛发酵液的抗氧化活性;SCU11在第5天所产角蛋白酶和碱性蛋白酶的活性分别是UMU4的1.6和1.2倍.在此基础上,将来自于SCU11的羽毛降解产物经HCl沉淀和疏水层析获得了4个抗氧化肽组分,其中组分F3的抗氧化活性最高.本研究表明芽孢杆菌SCU11较之UMU4具有更高的产酶活性及更强的羽毛降解能力,结果可为家禽羽毛的资源化应用奠定基础.

通过生物信息学分析,在本实验室分离得到的1株羽毛高效降解菌微白黄链霉菌Fea-10基因组中发现基因gm2886 (GenBank Accession Number:KY368946)可能编码一新的角蛋白酶,通过在该基因5'端和3'端分别连接红霉素抗性基因启动子(PermE)和组氨酸标签编码序列并构建在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSET 152上,接合转入密旋链霉菌Streptomyces pactum ACT 12,从而实现了异源表达,蛋白纯化后对其酶学性质进行了研究.实验结果表明,带有组氨酸标签编码序列的gm2886在密旋链霉菌ACT12中可以表达分泌得到1个大小约为36 kDa的蛋白.多种底物检测表明异源表达得到的重组蛋白GM2886-His6具有蛋白酶活性,可以降解水不溶性的天青角蛋白和羽毛粉;其最适温度和pH分别为50℃和pH 10.0.PMSF可抑制GM2886-His6的酶活,而EDTA不能,说明该酶为丝氨酸蛋白酶.本研究为从分子水平上解析羽毛高效降解菌Fea-10的活性机理,从而进一步开发其应用潜力提供了基础,同时可为该类蛋白酶的研究提供借鉴.

前期研究筛选获得1株能在60℃、48 h内降解完整羽毛的菌株YT06,通过形态学和16S rDNA分析,该菌株属于高温放线菌属(Thermoactinomyces sp.).利用单因素和正交试验优化YT06的产高温角蛋白酶条件,结果发现:最适培养条件为蔗糖15 g/L、NaNO38 g/L、羽毛5g/L,初始pH 9,培养温度60℃,转速180 r/min,摇床培养48 h后,角蛋白酶酶活为43.5 U/mL.当羽毛添加量为10 g/L时,降解产物中游离氨基酸含量高达3.328 mg/mL,其中,近50％的游离氨基酸为甘氨酸、缬氨酸和天冬氨酸.应用扫描电镜观察YT06对羽毛的降解过程,发现菌丝能穿透羽毛表面沿纵向生长,破坏羽毛角蛋白紧密的表面结构.红外光谱显示羽毛角蛋白的C—S键在降解之后消失,该结果能对高温放线菌降解羽毛角蛋白机制的研究提供依据.

寡肽具有较高的营养价值和多种生理功能,筛选高产寡肽的羽毛降解菌株,并将其用于羽毛寡肽的生产,对高效利用废弃羽毛资源、提高产品附加值具有重要意义.以寡肽产率为评价指标,从16株羽毛降解菌中分离到一株高产寡肽的羽毛降解菌H0,通过形态观察、生理鉴定和系统发育分析,初步鉴定菌株H0为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus).对其降解羽毛产寡肽特性和羽毛寡肽特征进行初步探究,发现该菌在最佳初始pH(11)和最佳温度(40℃)下发酵72 h,羽毛几乎完全降解,寡肽产率达38.19％(占可溶性总肽的67.53％),同时检测到11.11％的游离氨基酸.液质联用(LC-MS/MS)分析结果表明所产寡肽的分子量(Mr)主要分布在1 300以下,且主要是由5-10个氨基酸组成的短肽,富含支链氨基酸,推测其是羽毛降解液呈现抗氧化活性的主要原因.本研究表明甲基营养型芽孢杆菌H0具有较强的降解羽毛产寡肽能力,可为羽毛寡肽产品的开发提供优质微生物资源和科学依据.

旨为深入发掘角蛋白酶重要的基因资源,进一步提高其水解酶活,为工业生产提供理论基础.从分离于新疆戈壁沙漠的戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis)Ⅰ-0中克隆出一个编码角蛋白酶的基因并命名Dgker.构建原核表达载体pET-22b-Dgker并进行体外诱导表达纯化,通过对羽毛水解活性的测定探究粗酶液的最适温度和pH.结果 显示,Dgker蛋白N端前50个氨基酸对蛋白的表达纯化有很大影响.Dgker的重组菌株3d完全分解羽毛,在奶粉平板上重组菌株粗酶液比空载菌株粗酶液降解圈更显著.Dgker适应的温度和pH较为广泛其中最适温度是60℃、最适pH是5.0.Dgker能降解羽毛在以后的工业生产及处理废弃羽毛有极大的应用空间.

[背景]蛋白酶广泛应用于制革行业中,酶法脱毛对环境污染较小,但蛋白酶对化学试剂的不稳定性及胶原降解活性限制了其工业应用.[目的]克隆芽孢杆菌(Bacillus sp.) N1基因组的碱性蛋白酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组酶酶学性质及脱毛作用进行研究.[方法]利用基因组文库法克隆获得蛋白酶基因aprG,构建重组大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)pLysS/pET-28a-aprG.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达该重组酶,以福林酚显色法对其酶学性质进行研究,并将AprG作用于羊皮、兔皮和羽毛.[结果]克隆得到蛋白酶基因aprG,并实现其在大肠杆菌中的表达.重组酶AprG最适反应温度为50 °C,最适反应pH为10.0.各种金属离子对AprG活性影响较小,且AprG对表面活性剂和氧化剂、还原剂的耐受性较强.底物特异性分析表明,该酶胶原活性较低.AprG对羊皮和兔皮作用显著,且降解羽毛效果明显.[结论]蛋白酶AprG在制革行业中具有良好的应用前景.

以微生物降解为主的羽毛生物炼制是资源化利用其的重要手段之一,但机理不明是限制其进一步应用的瓶颈.突变体库筛选性状变异菌株的正向遗传学是研究分子机理的常用方案,该方案要求高效可靠的筛选方法.然而,目前依靠测酶活方法来决定降解能力,费时费力,难以用于大规模筛选.本文通过优化羽毛培养基成分及接种菌浓度,建立了一种用于筛选不同角蛋白降解能力微生物的筛选体系.利用该体系分析由mini Tn10构建的S.maltophinia DHHJ突变体库,得到了6株羽毛角蛋白降解能力减弱的突变体,筛选结果与酶活测试100％一致.该研究结果为寻找与角蛋白降解相关基因奠定了基础.

筛选和构建高效降解羽毛角蛋白的菌株,以提高角蛋白酶分泌表达量.从全国5个不同地方的猪、羊圈土壤中取样,在牛奶平板上进行初筛,以羽毛为唯一碳氮源对产角蛋白酶菌株进行复筛.通过形态学观察、16S rDNA序列分析,对菌株进行分类鉴定.为进一步提高菌株的发酵活力,筛选和优化了5个不同来源的信号肽序列(KerK、YoaW、DacB、NprE和SacB),选用pWB980作为表达载体,构建重组质粒并转化到Bacillus subtilis WB600进行表达.获得一株高效降解羽毛的菌株M,经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.).37℃C发酵培养48 h后,菌株M角蛋白酶酶活力为21.98 U/mL.通过筛选和优化信号肽,获得含有信号肽DacB的重组菌株R3-DacB,该菌株分泌表达角蛋白酶活力最高,达到了226.34 U/mL,是初始菌株M的10倍.获得了一株降解羽毛废弃物效果较好的重组菌株R3-DacB,对角蛋白酶实现工业化生产具有重要意义.

[目的]在长期堆放羽毛的家禽屠宰场取样,透明圈法筛选角蛋白酶高产菌株.[方法]以羽毛粉为唯一碳氮源进行初筛,再以脱脂牛奶为唯一碳氮源进行复筛,根据透明降解圈与菌落直径比的大小,筛选角蛋白降解能力较强的菌株,并对其进行菌株鉴定,结合酶活测定优化发酵条件.[结果]筛选得到一株角蛋白酶高产菌株B9,测定16S rDNA序列及生理生化特性分析,鉴定为粘质沙雷氏菌;结合酶活测定对其进行碳氮源、发酵温度、pH及发酵周期等条件优化,该菌株酶活力达到681.6 U·mL-1,为优化前的4.75倍.[结论]在家禽屠宰场取样,筛选得到一株角蛋白酶高产菌株,将其鉴定命名为Serratia marcescens B9,发酵条件优化后,酶活力显著提高,为羽毛角蛋白的降解提供新的微生物资源.