目的:观察探讨聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子（PSF）高表达对糖基化终末产物（AGEs）诱导下人视网微血管内皮细胞（hRMECs）氧化损伤的保护作用及相应分子机制。方法:将hRMECs分为正常组、空载组、PSF组、锌原卟啉（ZnPP）组及PSF+ ZnPP组进行实验。正常组细胞使用含有10％胎牛血清、青霉素/链霉素的DMEM培养基，置于37 °C、95％空气、5% CO 2的密闭恒温培养箱中培养。空载组细胞采用空载慢病毒感染。PSF组细胞采用过表达PSF慢病毒感染。ZnPP组细胞采用ZnPP （10 mol/L）处理2 h。PSF+ZnPP组细胞采用过表达PSF慢病毒感染后，再用ZnPP （10 mol/L）预处理2 h。后四组细胞辅以AGEs刺激，HE、Hoechst33258染色法和流式细胞法观察PSF高表达对细胞损伤的保护作用以及ZnPP对PSF的拮抗作用。采用Western blot检测细胞中血红素氧合酶-1 (HO-1)、磷酸化（p）细胞外调节蛋白激酶（ERK）、核因子2相关因子2 （Nrf2）的蛋白表达。引入ERK通路的特异性拮抗剂U0126，Western blot验证U0126对PSF蛋白所诱导的HO-1表达的逆转作用。 结果:HE染色和Hoechst33258染色结果显示，PSF组受损细胞核数较正常组明显增加，较PSF+ZnPP组明显减少，差异均有统计学意义（ F=27.5、38.7， P<0.05）。流式细胞法结果显示，PSF组细胞产生的ROS较正常组明显增加，较PSF+ZnPP组明显减少，差异有统计学意义（ F=126.4， P<0.05）。Western blot检测结果显示，PSF组HO-1蛋白表达量较正常组、空载组明显增加，差异均有统计学意义（ F=70.1， P<0.05）；AGEs处理30、60、120、240 min时pERK的蛋白表达量与15 min时比较，差异均有统计学意义（ F=474.0， P<0.05）；PSF+/U0126-组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF-/U0126-组明显增加，PSF+/U0126＋组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF+/U0126-组明显降低，差异有统计学意义（ F=30.2、489.4， P<0.05 ）。 结论:PSF高表达可以通过活化ERK通路，促进Nrf2转位入核进而诱导HO-1表达，从而保护hRMECs免受AGEs诱导的氧化损伤。

目的:观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（PSF）高表达对高浓度4-羟基壬烯醛（4-HNE）诱导下人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）内质网（ER）氧化应激损伤的保护作用。方法:体外培养的对数生长期hRMEC分为正常组、单纯4-HNE处理组（单纯4-HNE组），空载质粒联合4-HNE处理组（Vec+4-HNE组）、PSF高表达联合4-HNE处理组（PSF+ 4-HNE组）。单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞培养基加入10 μmol/L 4-HNE，刺激12 h。其后，Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组应用转染试剂脂质体2000分别导入pcDNA空载体、pcDNA-PSF真核表达质粒，转染24 h。正常组细胞常规培养。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；2'，7'-二氯二氢荧光素双乙酸盐探针检测各组细胞内活性氧（ROS）表达水平。蛋白质免疫印迹法检测各组细胞内ER氧化物蛋白1（Ero-1）、蛋白质二硫键异构酶（PDI）、C/EBP同源转录因子（CHOP）、葡萄糖调节蛋白（GRP）78、蛋白激酶R样ER激酶（pERK）/磷酸化pERK（p-pERK）、真核起始因子（eIF）2α/磷酸化eIF（peIF）、活化转录因子4（ATF4）蛋白相对表达量。组间比较行单因素方差分析。结果:单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞凋亡率分别为（22.50±0.58）%、（26.93±0.55）%、（11.70±0.17）%；细胞内ROS表达量分别为0.23±0.03、1.60±0.06、0.50±0.06。三组间细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（ F=24.531， P<0.05）；Vec+4-HNE组ROS表达水平较单纯4-HNE组、PSF+4-HNE组显著升高，差异有统计学意义（ F=37.274， P<0.05）。正常组、单纯4-HNE组、Vec+4-HNE组、PSF+4-HNE组细胞ER中Ero-1、PDI蛋白相对表达量分别为1.25±0.03、0.45±0.03、0.63±0.03、1.13±0.09和1.00±0.10、0.27±0.10、0.31±0.05、0.80±0.06；CHOP、GRP78蛋白相对表达量分别为0.55±0.06、1.13±0.09、0.90±0.06、0.48±0.04和0.48±0.04、1.25±0.03、1.03±0.09、0.50±0.06。4组Ero-1（ F=43.164）、PDI（ F=36.643）、CHOP（ F=42.855）、GRP78（ F=45.275）蛋白相对表达量比较，差异均有有统计学意义（ P<0.05）。4组细胞ER p-pERK/pERK（ F=35.755）、peIF2α/eIF（ F=38.643）、ATF4（ F=31.275）蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（ P<0.05）。 结论:PSF可抑制高浓度4-HNE诱导的细胞凋亡及ROS产生；其作用机制与恢复ER稳态平衡及下调pERK/eIF2α/ATF4通路的活化水平密切相关。

目的 观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)高表达对过氧化氢(H2O2)诱导下视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡的影响.方法 体外培养的人RPE细胞分为正常细胞组、损伤组(N+H2O2组)、空载体对照组(Vec+H2O2组)、PSF高表达组(PSF+H2O2组).应用脂质体2000将pEGFP空载体、pEGFP-PSF真核表达质粒分别导入Vec+H2O2组、PSF+H2O2组;N+H2O2组仅作转染处理;正常细胞组为正常培养细胞.细胞转染24 h后,以200 μmol/L H2O2刺激细胞2h.苏木精-伊红染色观察各组细胞形态;噻唑蓝比色法检测N+H2O2组、Vec+H2O2且、PSF+H2O2细胞活性,以酶联免疫检测仪测量波长490 nm处各组细胞的吸光度[A,旧称光密度(OD)]值表示;LIVE/DEAD(R)细胞活性/细胞毒性试剂盒检测各组细胞生存力;细胞凋亡检测试剂盒检测N+H2O2组、Vec+H2O2组、PSF+H2O2组细胞凋亡;二氯荧光素二乙酸酯检测各组细胞内活性氧(ROS)水平.结果 N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞体积缩小,胞质致密浓缩、嗜酸性染色增强;PSF+H2O2组细胞形态尚饱满,胞质染色较均匀,偶见体积缩小.与PSF+H2O2组比较,N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞活性下降,差异有统计学意义(F=46.98,P=0.000).正常细胞组细胞呈绿色,偶见红色荧光;N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞中呈红色荧光的死亡细胞数量明显增多,呈绿色荧光的活细胞数量显著减少;PSF+H2O2组活细胞数量明显增多,死亡细胞数量显著减少.与N+H2O2组、Vec+H2O2组细胞凋亡比较,PSF+H2O2组细胞凋亡下降,差异有统计学意义(F=62.24,P=0.000).与N+H2O2组、Vec+H2O2组比较,PSF+H2O2组细胞中ROS表达量下降,差异有统计学意义(F=295.235,P=0.000).结论 高表达PSF通过抑制ROS的产生缓解H2O2诱导的人RPE细胞凋亡.

目的 观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)高表达对糖基化终末产物(AGEs)诱导下RPE细胞损伤的保护作用.方法 将体外培养的人RPE细胞分为正常对照组(N组)、空白对照组(N+AGAGEs组)、空载体对照组(Vec+AGEs组)、PSF高表达组(PSF+AGEs组).N组RPE细胞常规培养;N+AGEs组只做转染处理但不导入任何外源性基因的RPE细胞联合AGEs诱导;Vec+AGEs组、PSF+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将pcDNA空载体或pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞联合AGEs诱导.除N组以外,其余3组细胞进行相应的转染处理,24 h后应用150 μg/ml的AGEs刺激72 h.采用HE染色和Hoechst33258染色观察PSF高表达对RPE细胞凋亡相关形态改变的影响;通过ROS水平检测分析PSF高表达对AGEs诱导的RPE细胞ROS表达的影响;采用MTT比色法检测PSF高表达对RPE细胞生存力的影响;采用Western blot检测PSF不同作用时间及不同剂量对血红素氧合酶1(HO-1)表达的影响.结果 HE染色和Hoechst 33258染色观察发现,N组细胞形态饱满,细胞核呈圆形,细胞质丰富,染色均一;N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小,嗜酸性染色增强,细胞核致密浓染、固缩甚至碎裂;PSF+AGEs组细胞形态尚饱满,细胞浆染色较均匀,细胞核染色均一.MTT比色法检测结果显示,PSF高表达可有效提高RPE细胞生存力,但该作用可被ZnPP有效拮抗,且差异有统计学意义(F=33.26,P＜0.05).DCFH-DA法检测结果显示,与N+AGEs组、Vec+AGEs组比较,PSF+AGEs组细胞中ROS产量下降,差异有统计学意义(F=11.94,P＜0.05).Westernblot检测结果显示,PSF蛋白以时间、剂量依赖性的方式上调HO-1的表达水平.PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相对表达水平较0h明显升高,差异有统计学意义(F=164.91,P＜0.05).0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μgPSF蛋白作用下的HO-1相对表达水平较0.0 μg明显升高,差异有统计学意义(F=104.82,P＜0.05).结论 PSF可能通过上调HO-1的表达而抑制ROS产生,从而对AGEs诱导下的RPE细胞损伤发挥保护作用.

目的 观察慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管的抑制作用.方法 5日龄C57BL/6J小鼠1 12只随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组(以下简称Vec组)及OIR模型+PSF慢病毒处理组(以下简称PSF组),分别为16、32、32、32只.小鼠7日龄时,正常对照组小鼠常规环境饲养;单纯0IR模型组、Vec组及PSF组小鼠建立OIR模型.小鼠12日龄时,Vec组、PSF组小鼠玻璃体腔分别注射滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1μl.正常对照组和单纯OIR模型组小鼠不再做任何处理.小鼠17日龄时,采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;作视网膜铺片,测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积;采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的mRNA相对表达量;采用Westernblot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相对表达量.组间比较采用单因素方差分析.结果 正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个;视网膜无灌注区面积分别为0.00％、(35.71±2.81)％、(36.57±4.53)％、(15.33±4.75)％.4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数及视网膜无灌注区面积比较,差异均有统计学意义(F=24.87、165.70,P＜0.05).组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组较正常对照组突破内界膜的血管内皮细胞核数增多,视网膜无灌注区面积增大;PSF组较单纯OIR模型组、Vec组突破内界膜的血管内皮细胞核数减少,视网膜无灌注区面积减小,差异均有统计学意义(P＜0.05).实时定量PCR及Western blot检测结果显示,4组间小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量(F=53.66、83.54)以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量(F=58.38、52.69、24.79)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低,PSF组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 慢病毒介导的PSF可通过上调Nrf2及HO-1的表达抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成.