目的 研究天麻蛋白对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)诱导的HT22细胞损伤的保护作用及机制.方法 将体外HT22细胞常规培养,生长至对数生长期后铺板并随机分为对照组、OGD/R组、依达拉奉组、天麻蛋白组.以连二亚硫酸钠(Na2S2O4)10 mmol·L-1合并无糖DMEM培养基造成氧糖剥夺培养2 h,继而恢复为无血清高糖DMEM培养2 h进行复糖复氧处理,以建立体外OGD/R模型.依达拉奉和天麻蛋白为自氧糖剥夺前24 h开始即加入相应药物终浓度,持续至复糖复氧结束.采用MTT法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)法测定LDH泄露率,试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,丙二醛(MDA)含量及活性氧(ROS)水平,流式细胞技术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,Western blot检测OGD/R诱导损伤的HT22细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-AMPK、AMPK、Nrf2、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平变化.结果 与对照组相比,OGD/R组细胞存活率下降(P<0.01),LDH泄露率升高(P<0.01),SOD、GSH-PX活性下降(P<0.01),MDA含量及ROS水平增加(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.01),Bcl-2蛋白的表达量下降(P<0.01),Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达量升高(P<0.01);与OGD/R组相比,天麻蛋白可提高细胞存活率(P<0.01),降低LDH泄露率(P<0.01),提高SOD活性及GSH-PX活性(P<0.01),降低MDA含量及ROS水平(P<0.01),降低细胞凋亡率(P<0.01),上调HT22细胞中Bcl-2、p-AMPK、Nrf2入核、HIF-1α、VEGF蛋白的表达量(P<0.01),有效抑制Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达(P<0.01).结论 天麻蛋白对HT22细胞OGD/R损伤具有神经保护作用,其机制与活性氧/线粒体凋亡通路、AMPK-Nrf2通路和缺氧诱导因子通路相关蛋白密切相关.

目的 探讨氮气(N2)与连二亚硫酸钠(Na2 S2 O4)在构建H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤模型中的应用价值.方法 培养H9C2心肌细胞,当细胞生长状态良好时,分别用N2、不同浓度的Na2 S2 O4作用于心肌细胞,在不同时间点检测心肌细胞存活率.结果 与空白组比较,各浓度Na2 S2 O4组的心肌细胞存活率均降低,差异均有统计学意义(P<0.05).与正常氧对照组比较,各缺氧组的细胞存活率均下降,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 N2与Na2S2O4均能造成H9C2心肌细胞缺氧复氧损伤,效果均较为显著.

目的:研究瓜蒌皮提取物对缺氧/复氧损伤H9c2心肌细胞的保护作用及其机制.方法:以采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)为化学缺氧剂,建立大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,筛选不同浓度Na2S2O4(0.625～10 mmol/L)和不同缺氧时间(10～60 min)、复氧时间(2～8 h)的造模条件,以及瓜蒌皮提取物给药浓度(12.5～400μg/mL).将细胞分为正常组、模型组、瓜蒌皮提取物不同剂量组(即TPE低、中、高剂量组,25、50、100μg/mL)和阳性对照组(槲皮素,25μmol/L),加入相应药物进行预处理24 h后,再建立缺氧/复氧损伤模型.采用MTT法检测各组细胞存活率;采用酶联免疫吸附法检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;采用流式细胞术观察细胞凋亡情况;采用Western blotting法检测细胞中Bax、Bcl-2的蛋白表达水平.结果:心肌细胞缺氧/复氧损伤造模条件为Na2S2O4造模浓度2.5 mmol/L,缺氧时间30 min,复氧时间4 h;12.5～400μg/mL的瓜蒌皮提取物对细胞均无毒性.分组处理后结果显示,与空白组比较,模型组细胞存活率显著降低、凋亡率显著升高,细胞中CK-MB、LDH、MDA水平均显著升高,SOD水平显著降低,Bax的蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值均显著升高,Bcl-2的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,瓜蒌皮提取物各剂量组细胞上述变化均被逆转(P<0.05或P<0.01).结论:瓜蒌皮提取物对缺氧/复氧损伤心肌细胞具有一定的保护作用;其机制可能与抑制细胞中脂质过氧化物的增加、提高细胞清除活性氧自由基的能力、上调Bcl-2/下调Bax蛋白表达等,从而抑制细胞凋亡有关.

目的 通过构建H9c2心肌细胞缺氧模型,观察丹蒌片对心肌缺血损伤及心肌细胞钙超载的影响,并探讨其作用机制.方法 取对数生长期的大鼠H9c2心肌细胞,采用加入连二亚硫酸钠(Na2S204)的方法建立心肌细胞缺氧损伤模型,通过外源性给予丹蒌片含药血清,采用细胞形态学观察法,MTT法检测细胞活性,采用激光共聚焦法检测各组心肌细胞内游离Ca2+浓度,采用蛋白免疫印迹技术检测钙超载磷酸化钙调蛋白依赖性激酶(p-CaMKⅡ)、钙调蛋白激酶(CaMK Ⅱ)的表达.结果 通过细胞形态观察及MTT量效实验,确定采用5 mmoFL Na2SO4缺氧处理2h以建立稳定的心肌细胞缺氧损伤模型.与对照组比较,模型组心肌细胞内游离Ca2+水平显著升高,P-CaMK Ⅱ表达增加;与模型比较,抑制剂组及丹蒌片组心肌细胞内游离Ca2+水平均显著降低,P-CaMK Ⅱ表达降低(均P＜0.05或P＜ 0.01).结论 丹蒌片对心肌缺血损伤的保护作用可能与其减少外钙内流、降低内钙释放,调节P-CaMKⅡ表达有关.

目的 探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)与Activin A/Smads信号在体外缺血性脑损伤中的相互作用机制.方法 使用鼠神经生长因子诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞神经元样转化,利用连二亚硫酸钠(NaS2 O4)构建细胞氧糖剥夺模型(OGD),计时0 h和1 h.Western blot检测外源性ActA或JNK磷酸化抑制剂SP600125干预后,OGD不同时间Smad3、JNK1总蛋白和磷酸化蛋白的表达情况.结果 OGD损伤后JNK1磷酸化蛋白表达升高27.1％.与对照组相比,外源性ActA下调JNK1蛋白的磷酸化水平,在OGD 0 h和1 h时分别下降了67.8％和56.4％.SP600125通过抑制JNK1磷酸化,上调Smad3的磷酸化水平.与DMSO对照组相比,在OGD 0 h和1 h时,SP600125组磷酸化Smad3表达分别升高了142.5％和60.5％.结论 JNK与ActA/Smads通路之间存在负性调控作用.

目的 优化川芎酚酸类成分提取纯化工艺条件,探讨其对缺氧损伤神经细胞的保护作用.方法 采用L9(34)正交实验,以总酚酸含量为考察指标,对醇浓度、提取次数、提取时间、溶剂用量4个因素进行考察,优选最佳提取工艺条件;采用大孔吸附树脂纯化方法,通过静、动态吸附与解吸实验,对不同型号树脂、上样药液浓度、泄露曲线、上样pH值、洗脱醇浓度、洗脱醇用量、除杂体积进行考察,优选最佳纯化工艺条件;以连二亚硫酸钠(Na2 S2 O4)为造模剂,考察川芎酚酸类成分纯度高低对其缺氧神经细胞损伤保护作用的影响.结果 最佳提取工艺为8倍量90％乙醇回流提取3次,每次2 h;最佳纯化工艺为HPD-300大孔吸附树脂,上样浓度0.2 g?mL-1,树脂比上柱量为1 g?mL-1(药材/湿树脂),先用1倍柱体积(BV)水洗脱,弃去水洗液,再用90％乙醇洗脱8 BV,经二次纯化得酚酸类成分最终纯度为70％.回收率为80％.纯化后,酚酸类成分对缺氧神经细胞的保护作用显著提高,半数抑制浓度(IC50)比纯化前降低48％.结论 该工艺条件稳定可行,可为川芎酚酸类成分的临床合理应用与开发奠定基础.

目的 通过构建H9c2心肌细胞缺氧模型,并基于线粒体通路和MAPK信号通路,探讨丹蒌片对心肌缺血损伤的保护作用.方法 取对数生长期的大鼠H9c2心肌细胞,采用加入连二亚硫酸钠(Na2S2O4)的方法建立心肌细胞缺氧损伤模型,按空白对照组、模型组、抑制剂组和给药组,采用蛋白免疫印迹法分别检测心肌细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3,心肌细胞相关蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK以及p38、p-p38的表达.结果 与模型组相比,给药组能升高Bcl-2的表达,降低Bax、cleaved Caspase 3的表达,同时显著上调Bcl-2/Bax的比率(P＜0.001);与抑制剂组相比,给药组能升高Bcl-2的表达,降低Bax、cleaved Caspase 3的表达,同时显著上调Bcl-2/Bax的比率(P＜0.05).与模型组相比,给药组能显著降低p-ERK、p-JNK和p-p38的蛋白水平(P＜0.01);与抑制剂组相比,给药组能显著降低p-ERK和p-JNK的蛋白水平(P＜0.01),而p-p38无明显差异(P＞0.05).结论 丹蒌片对心肌缺血损伤的保护作用可通过调节线粒体通路抑制细胞凋亡,并与激活MAPK信号通路有关.

研究肉豆蔻-8散提取物对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其与酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信号转导子和激活子3(STAT3)信号通路的关系.使用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)建立H9c2细胞缺氧/复氧损伤模型;采用CCK-8法检测细胞活力;采用全自动生化分析仪检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量;采用试剂盒法测定细胞中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量;采用Hoechst染色法检测细胞凋亡程度;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组心肌细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax的蛋白表达.Na2S2O4对H9c2细胞活力的半数抑制量为2mmol/L;与模型组比较,不同浓度肉豆蔻-8散提取物均能提高细胞活力;能显著降低细胞培养液中CK、LDH、AST的水平、能显著增加细胞中CAT、SOD、GSH-Px的水平;同时可显著增加p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2的蛋白表达、显著减少Bax的蛋白表达,而AG490阻断剂组可减弱肉豆蔻-8散提取物的作用.肉豆蔻-8散通过JAK2/STAT3信号通路发挥对Na2S2O4诱导缺氧/复氧损伤心肌细胞的保护作用.

目的 验证连二亚硫酸钠还原法对敌草快中毒快速检测评估的可行性.方法 通过体外配制出不同浓度敌草快尿液样本,模拟不同中毒程度患者尿液情况,然后利用连二亚硫酸钠还原作用呈现颜色差异,对毒物浓度进行评估.结果 含有不同浓度敌草快的尿液标本,在连二亚硫酸钠作用下,呈现不同的绿色,并且颜色深度与敌草快浓度密切相关.结论 利用连二亚硫酸钠还原反应,可以快捷有效地对尿液中敌草快进行初步鉴别和半定量浓度判断.

目的 研究PI3K/Akt信号通路在瓜蒌皮保护心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用.方法 以2.5 mmol/LNa2S2O4诱导心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型,实验分为正常组、模型组、瓜蒌皮提取物组及抑制剂组.应用MTT法检测细胞活力;流式细胞术观察细胞凋亡情况;Western Blot测定Akt、p-Akt(Ser 473)、Bax、Bcl-2的蛋白表达水平.结果 与模型组相比,瓜蒌皮提取物预处理24h后能改善心肌细胞形态,明显提高心肌细胞活力.瓜蒌皮提取物能促进Akt、p-Akt(Ser 473)及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制促凋亡蛋白Bax的表达,减少心肌细胞凋亡.PI3K抑制剂LY294002与瓜蒌皮提取物联合处理后,逆转了瓜蒌皮提取物对心肌细胞的上述作用,导致细胞凋亡率上升.结论 瓜蒌皮提取物可能通过激活PI3K/Akt信号通路改善缺氧/复氧损伤诱导的心肌细胞凋亡.