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2型猪链球菌酪氨酸激酶基因的原核表达及表达产物抗血清的制备
编辑人员丨2023/8/6
目的 制备2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)酪氨酸激酶Cps2C重组蛋白及其抗血清,为进一步研究Cps2C的作用奠定基础. 方法 采用在线工具对cps2C基因进行生物信息学分析.设计cps2C基因引物,以05ZYH33菌株基因组DNA为模板PCR扩增cps2C基因,构建pET32a:cps2C重组质粒;重组质粒转入感受态E.coli BL21后,IPTG诱导表达Cps2C重组蛋白,经Ni2+亲和层析纯化后用His单克隆抗体进行鉴定.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗血清,采用间接ELISA法测定抗体效价. 结果 成功构建pET32a:cps2C表达质粒,获得阳性E.coli BL21 Cps2C重组蛋白表达菌株,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白条带单一,相对分子质量为43×103,与预期一致;Western blot检测Cps2C重组蛋白可以与His单克隆抗体、感染05ZYH33全菌的猪恢复期血清反应.制备的多克隆抗血清效价为1∶819 200,且能与重组蛋白反应. 结论 原核表达了具有抗原性的Cps2C重组蛋白,制备的鼠源多抗血清能识别Cps2C蛋白,为研究Cps2C蛋白在2型猪链球菌中的作用奠定了基础.
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编辑人员丨2023/8/6
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2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株的构建
编辑人员丨2023/8/5
目的 构建2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株,为cps2C基因功能研究提供实验材料.方法 使用重叠延伸PCR技术将延伸因子TufA(又名EF-Tu,编码基因为SSU05_0530)的启动子(命名为P0530)与cps2C基因连接为P0530cps2C片段,将P0530cps2C酶切后连接至猪链球菌-大肠埃希菌穿梭质粒pSET2,构建过表达质粒pSET2∷P0530cps2C.将pSET2∷P0530cps2C电转化导入S.suis 2野生毒株05ZYH33感受态细胞,抗性及组合PCR筛选得到cps2C过表达株.qRT-PCR检测过表达株cps2C基因的转录水平.结果 重叠延伸PCR成功将P0530启动子片段(300 bp)和cps2C基因片段(696 bp)拼接为P0530cps2C(996 bp),片段及载体经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后连接,成功构建出过表达质粒pSET2∷P0530cps2C;将pSET2∷P0530cps2C电转化导入S.suis 2 05ZYH33感受态细胞,抗性筛选及组合PCR检测结果显示cps2C过表达株构建成功.提取野生株05ZYH33和cps2C过表达株总RNA后进行qRT-PCR实验,结果显示过表达株cps2C基因的相对表达水平较05ZYH33株上调2.4倍.结论 本研究选用S.suis2 05ZYH33的延伸因子TufA强启动子P0530作为启动子,成功构建过表达质粒pSET2∷P0530cps2C并导入S.suis 2感受态细胞,成功获得cps2C过表达株,为进一步研究酪氨酸激酶Cps2C功能提供实验材料.
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编辑人员丨2023/8/5
