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重组人干扰素λ1在HEK-293F细胞中的表达及鉴定
编辑人员丨2023/9/16
目的 采用HEK-293F细胞瞬时转染表达重组人干扰素λ1(recombinant human interferonλ1,rhIFNλ1),并进行鉴定.方法 通过2种信号肽[T细胞受体(T cell receptor,TCR)和天然信号肽(nature signal peptide,NSP)]、3种载体[pcDNA3.4、泛染色质开放原件(ubiquitous chromatin opening element,UCOE)、PFR]和目的基因 rhIFNλ 1 构建6种信号肽-载体组合的重组质粒,以HEK-293F为宿主细胞,摇瓶规模瞬时转染表达rhIFNλ1.选择NSP及载体UCOE构建低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ,瞬时转染HEK-293F细胞,表达产物经阳离子交换层析(HiTrap SP FF)、蓝胶层析(HiTrap Blue HP)和分子筛凝胶过滤层析(Sephacryl S-100 HR)3步纯化,纯化产物进行Western blot及反相HPLC分析,并检测质谱分子量及N-末端氨基酸序列.结果 6种重组质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确.随着转染时间的延长,6种表达产物的表达量逐渐增加,转染6 d时最高,达10～20 mg/L.低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ经双酶切及测序鉴定,证明构建正确.重组质粒UCOE-Q46-λ转染HEK-293F细胞6 d,细胞培养上清纯化产物的相对分子质量约27 800,纯度达97.372％,且可与小鼠抗人IL-29/IFNλ1单克隆抗体发生特异性结合;反相HPLC检测分析可见2个峰,出峰时间分别为15.6和20.0 min;质谱分子量约为24 000;N-末端5个氨基酸序列为G-P-V-P-T.结论 HEK-293F细胞表达的rhIFNλ1纯度较高,为该蛋白的进一步研究奠定了基础.
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编辑人员丨2023/9/16
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N-糖基化位点突变的人IFN-λ1在毕赤酵母中的表达、纯化及表征
编辑人员丨2023/8/6
IFN-λ1是Ⅲ型干扰素家族的一个成员,具有与Ⅰ型干扰素相似的功能.此前,我们已经从毕赤酵母表达获得了可溶性重组人干扰素-λ1.然而,毕赤酵母表达中的高糖基化带来了免疫原性,影响了蛋白质的生产纯化效率.为了克服这个缺点,文中构建了一种干扰素突变体(rhIFN-λ1-Nm),定点突变潜在糖基化位点.AOX1启动子与α因子信号序列存在的情况下,用甲醇诱导成功地实现了rhIFN-λ1-Nm在毕赤酵母GS115胞外分泌表达.对 rhIFN-λ1-Nm进行纯化,获得了纯度>98％的产品,并对糖化水平、分子量、二级结构、N末端序列等理化性质和生物活性进行了研究.研究结果表明,rhIFN-λ1-Nm糖基化水平明显降低,蛋白质生产纯化收率显著提高,而对结构和生物活性无影响;糖基化位点突变rhIFN-λ1可以被开发为IFN-λ1的替代品,有望发展成为未来的生物免疫制剂.
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编辑人员丨2023/8/6
